豬繁殖與呼吸綜合征病毒XINX株的分離及NSP2基因的遺傳進(jìn)化分析

摘要：為了了解豬繁殖與呼吸綜合征病毒在河南地區(qū)豬體內(nèi)的進(jìn)化情況，筆者采集了河南新鄉(xiāng)地區(qū)出現(xiàn)的疑似豬繁殖與呼吸綜合征的流產(chǎn)豬胎，并進(jìn)行了病毒的分離鑒定，同時(shí)對(duì)分離病毒株的NSP2基因部分序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果共分離并鑒定出1株美洲型豬繁殖與呼吸病毒XINX，且NSP2基因部分序列的分析顯示，該毒株與以往的分離毒株不同，其NSP2基因存在393 bp的不連續(xù)缺失，同國(guó)內(nèi)之前報(bào)道的經(jīng)典毒株和高致病性毒株間均存在較大差異，目前在國(guó)內(nèi)尚數(shù)首次出現(xiàn)。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分子進(jìn)化提供了重要信息。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；Marc-145；NSP2；遺傳進(jìn)化分析

中圖分類號(hào)： S855.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0180-03

收稿日期：2013-11-15

基金項(xiàng)目：國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金（編號(hào)：30500254）。

作者簡(jiǎn)介：周峰（1988—），男，河南固始人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)榉肿硬≡瓕W(xué)。E-mail：290679317@qq.com。

通信作者：楊霞，副教授，研究方向?yàn)榉肿硬≡瓕W(xué)。E-mail：yangxia66@163.com。豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種豬的重要傳染病，該病以懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎以及仔豬和育肥豬發(fā)生呼吸道疾病為主要特征。PRRS于1987年在美國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已波及全球，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。我國(guó)于1996年首次在流產(chǎn)的豬胎中分離到PRRSV，并相繼發(fā)現(xiàn)了多種變異毒株[3-5]。目前，PRRSV主要包括以Lelystad virus（LV）為代表的歐洲型（type1，European type）和以VR-2332為代表株的北美洲型（type2，North American type）2種基因型，在中國(guó)主要流行美洲型。PRRSV病毒基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約為15 kb，包括10個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs）和2個(gè)非編碼區(qū)（UTRs）[6]。ORF1a、ORF1b大約占了病毒基因組的80%，分別編碼pp1a、pp1ab這2個(gè)復(fù)制多聚蛋白，并最終被ORF1a編碼的蛋白水解酶切割成14個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structure protein，NSP）[7-8]；ORF2a、ORF2b分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b；ORFs3-7分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白GP3、GP4、GP5、M、N蛋白[9]。研究表明，NSP2是PRRSV基因組中最容易發(fā)生變異的基因[10]，高致病性PRRSV（HP-PRRSV）的NSP2基因在第482位和第533～561位缺失30個(gè)不連續(xù)的氨基酸[11-14]，這些缺失可能與2006年中國(guó)出現(xiàn)的HP-PRRSV的毒力有關(guān)。基于這個(gè)原因，NSP2已經(jīng)成為PRRSV流行病學(xué)調(diào)查和系統(tǒng)進(jìn)化分析中的一個(gè)重要標(biāo)記[14]。本研究首先采集疑似病料并進(jìn)行病毒的分離鑒定；然后在NSP2基因序列測(cè)定與分析的基礎(chǔ)上證實(shí)，所分離毒株為PRRSV變異株，將其命名為XINX。研究結(jié)果為防控河南新鄉(xiāng)地區(qū)PRRS的發(fā)生及進(jìn)一步開(kāi)展該病毒分子流行規(guī)律、遺傳變異及疫苗研制等提供了理論支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1樣品試驗(yàn)樣品為2012年采自河南新鄉(xiāng)地區(qū)某豬場(chǎng)疑似PRRS的流產(chǎn)豬胎，樣品置于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑Marc-145細(xì)胞，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清，購(gòu)自北京四季青公司；Taq DNA聚合酶、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、RNA酶抑制劑（Rnase Inhitor）、dNTP、pMD18-T載體，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DEPC，購(gòu)自Amresco公司；Trizol Reagent，購(gòu)自Invitrogen公司；瓊脂糖，購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3引物參考PRRSV VR2332株（GenBank登錄號(hào)EF536003）和JXA1（GenBank登錄號(hào)EF112445）NSP2全基因序列，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)針對(duì)NSP2高變區(qū)的特異性引物，詳見(jiàn)表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。表1PRRSV NSP2基因擴(kuò)增引物

引物名稱及序列（5′→3′）擴(kuò)增區(qū)域目的基因片段長(zhǎng)度（bp）NSP2-F：ACCCTTCCYGAAAGAGTRAG；NSP2-R：CCTCATATTCMGTCTGTGAGGAHGC1388～2915NSP21 528左右

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病毒分離取適量流產(chǎn)豬胎的脾、肺、淋巴結(jié)，剪碎后用PBS稀釋后研磨，凍融3次，8 000 r/min離心10 min后取上清，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，分裝后于-70 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ螌愉仢M90%的Marc-145細(xì)胞，用上述處理的病料接種細(xì)胞，37 ℃吸附1 h后，加入含有2%胎牛血清的維持液，于37 ℃ CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 若無(wú)典型細(xì)胞病變（CPE），則根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)在接毒后4～5 d進(jìn)行收毒，繼續(xù)盲傳直至出現(xiàn)典型的PRRSV CPE。當(dāng)CPE達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行收毒，于-20 ℃經(jīng)3次反復(fù)凍融后，8 000 r/min室溫離心 2 min，取上清按上述方法繼續(xù)接種到Marc-145細(xì)胞進(jìn)行病毒傳代。

1.2.2病毒液RNA的提取取上清參照Trizol reagent說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，所提取基因組RNA用30 μL 1‰ DEPC水溶解，-70 ℃保存?zhèn)溆谩ndprint

1.2.3PRRSVNSP2基因RT-PCR擴(kuò)增與測(cè)序。提取上述部分陽(yáng)性樣品中的總RNA，以20 μL體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：13 μL RNA模板，4 μL 5×buffer，1 μL dNTP（10 mmol/μL），1 μL 隨機(jī)引物（20 pmol/μL），0.5 μL RNA酶抑制劑（40 U/μL），0.5 μL反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV （200 U/μL）。反應(yīng)條件：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min，將得到的cDNA用于PCR擴(kuò)增。

PCR按50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行：5 μL 10×buffer，5 μL MgCl2 （25mmol/μL），5 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA），1 μL dNTP（10 mmol/μL），0.5 μL Taq DNA聚合酶，各1 μL上下游引物，補(bǔ)加滅菌雙蒸水至50 μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后，將陽(yáng)性克隆送北京華大基因公司測(cè)序。

1.2.4序列分析所得序列經(jīng)過(guò)NCBI網(wǎng)站上的BLAST比對(duì)后，運(yùn)用DNAStar中的MegAlign將測(cè)序結(jié)果與參考毒株（表2）的NSP2基因進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析。

2結(jié)果與分析

2.1病毒分離

將病料濾液接種到Marc-145細(xì)胞上，盲傳至第7代時(shí)，可產(chǎn)生穩(wěn)定、典型的PRRSV細(xì)胞病變（CPE），即接毒48 h左右可見(jiàn)少量輕微的細(xì)胞聚集，72 h左右有大量的細(xì)胞聚集成堆，80%以上細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE（圖1）。

2.2PRRSV NSP2基因部分序列的鑒定

以病變細(xì)胞懸液總RNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得1條比1 528 bp低400 bp左右的DNA片段（圖2）。將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化后，提取陽(yáng)性質(zhì)粒送北京華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小為1 124 bp。目前序列已提交至GeneBank，登錄號(hào)為KF000084。

2.3NSP2基因部分序列分析

在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站的BLAST結(jié)果顯示，NSP2與國(guó)外流行毒株NADC30的核苷酸序列相似性最高。用DNAstar中的MegAlign進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析，結(jié)果表明，與經(jīng)典毒株VR2332比較，XINX分別在第964～1 296、1 452～1 454、1 515～1 571位共計(jì)缺失393個(gè)核苷酸。NSP2與經(jīng)典毒株參考毒株VR2332、BJ-4、CH-2a的核苷酸序列相似性為67.6%，與HP-PRRSV參考毒株

JXA1、TJ、HUN4、HEB1、09HEN1的核苷酸序列相似性為638%～644%，與歐洲型參考毒株Lelystad virus核苷酸序列的相似性為45.6%；而與國(guó)外流行毒株NADC30核苷酸序列相似性最高，為95.2%。利用Mega 4.0中的鄰接法（Neighbor-Joining；bootstrap values of 1000 replicates）對(duì)NSP2基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明，XINX與美洲型PRRSV處于同一大分支，但是既不與經(jīng)典毒株處于同一分支，又與HP-PRRSV的親緣關(guān)系相差較遠(yuǎn)，而是與國(guó)外流行毒株NADC30處于同一進(jìn)化分支（圖3）。

3結(jié)論

PRRS是一種對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)都具有重大影響的豬傳染性疾病，它能夠引起懷孕母豬流產(chǎn)和新生仔豬的呼吸道疾病。該病于1987年在美國(guó)和加拿大首次被發(fā)現(xiàn)，隨后在日本、德國(guó)以及其他國(guó)家相繼被發(fā)現(xiàn)。我國(guó)于1995年首次發(fā)現(xiàn)該病，并導(dǎo)致了重大經(jīng)濟(jì)損失。2006年春季，在我國(guó)東部地區(qū)暴發(fā)了一場(chǎng)以高發(fā)病率和高死亡率為特點(diǎn)的PRRS，隨后開(kāi)始向全國(guó)蔓延。近些年來(lái)，PRRS對(duì)河南省養(yǎng)豬業(yè)也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)PRRSV進(jìn)行嚴(yán)密監(jiān)視顯得尤為重要。

NSP2基因作為PRRSV整個(gè)基因組中最容易變異的區(qū)域，具有明顯的多樣性，它在同一基因型中和不同基因型之間的變異都很大，且具有很高的耐缺失和插入的能力；此外，由于NSP2的蛋白酶活性，使其能在調(diào)節(jié)宿主免疫和病毒復(fù)制方面具有至關(guān)重要的作用。因此NSP2常常作為監(jiān)視PRRSV變異的重要標(biāo)記。

PRRSV XINX分離株是從河南省新鄉(xiāng)地區(qū)某縣養(yǎng)豬場(chǎng)疑似PRRS引起的流產(chǎn)豬胎中分離出來(lái)的，NSP2基因序列比對(duì)結(jié)果表明，該毒株既不屬于經(jīng)典毒株，又與HP-PRRSV有很大差別，而與國(guó)外流行毒株NADC30序列相似性卻很高，其393個(gè)核苷酸的缺失在國(guó)內(nèi)也屬首次出現(xiàn)。表明有新的PRRSV缺失毒株在我國(guó)出現(xiàn)，且有外來(lái)毒株的可能性，提示需要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)于豬及其相關(guān)產(chǎn)品的入境檢疫。此外，通過(guò)了解和持續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，免疫活疫苗的該豬場(chǎng)，經(jīng)典的PRRSV和以缺失30個(gè)氨基酸為特點(diǎn)的HP-PRRSV檢出率很低，而XINX毒株的陽(yáng)性率卻很高，提示該病毒可能通過(guò)某種途徑逃避宿主免疫監(jiān)視，但該缺失變異是否與毒株的毒力、生長(zhǎng)特性等生物學(xué)特征相關(guān)，尚需進(jìn)一步深入研究。

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