香椿組織培養技術研究

王曉蕾，方國臻

（天津科技大學，天津300457）

香椿（Toona sinensisRoem）是楝科香椿屬喬木，樹干通直，生長迅速，具有很高的營養價值、藥用價值和食療價值。

隨著生活水平的提高，人們逐漸加深對健康飲食的認識，香椿的營養價值也越來越被人們認可，在香椿組織培養中容易出現褐化、葉片污染、莖段污染等現象[1-4]。

通過研究香椿組織培養技術，可以擴大香椿幼苗的生產量，縮短香椿幼苗的生長周期，進而縮短香椿樹生長嫩葉的時間，從而降低香椿嫩葉的市場價，讓普通大眾更容易接受。達到利用食品生物技術實現香椿的商業價值的目的。

1 材料、試劑和儀器

1.1 材料

香椿、香椿種子：由實驗室提供。

1.2 試劑

乙醇（分析純）：天津市化學試劑一廠；升汞（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；B5培養基（生化試劑）：上海宇涵生物技術有限公司；蔗糖；瓊脂；碳酸鈉。

1.3 儀器、型號及生產廠家

SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SHP-250生化培養箱：上海山連實驗設備有限公司；DHG電熱恒溫鼓風干燥箱：鞏義市予華儀器有限責任公司；電子天平、電磁爐、電子計價秤、電子天平。

2 方法

2.1 香椿組織培養

2.1.1 香椿組織培養方案1

2.1.1.1 制作B5培養基

取B5培養基3.25 g、30 g/L蔗糖、0.8%瓊脂，將混合物放于燒杯中，加入1L蒸餾水，在電磁爐上煮沸。將混合均勻的培養基倒入三角瓶中。然后將培養基，培養瓶，紗布置于立式壓力蒸汽消毒器中滅菌30 min。滅菌結束后，將培養基倒入培養瓶中，即制成B5培養基。

2.1.1.2 培養香椿幼苗

將香椿種子去殼，除去雜物，用水清洗2次。然后將種子置于燒杯中浸泡，放到25℃恒溫箱中（12 h）。除去漂浮的種子，清洗下層的種子，將其置于盤子中，用濕紗布蓋上，放到25℃恒溫箱中（12 h）。取少許種子，放于培養皿中，用75%酒精溶液消毒20 s，再用0.1%升汞溶液消毒5 min，無菌水沖洗4次～6次。在超凈臺中將種子接種于B5培養基中，香椿種子的小頭朝下接種，培養無菌香椿幼苗。

2.1.1.3 香椿組織培養

在超凈臺上，挑取生長良好的無菌苗，切取其葉片，再次接種到B5培養基（含6-芐基嘌呤和萘乙酸）中。

2.1.1.4 觀察組培苗的生長狀況

每天觀察組培苗的生長狀況。

2.1.2 香椿組織培養方案2

2.1.2.1 制作B5培養基

取B5培養基3.25 g、30 g/L蔗糖、0.8%瓊脂，將混合物放于燒杯中，加入1L蒸餾水，在電磁爐上煮沸。將混合均勻的培養基倒入三角瓶中。然后將培養基，培養瓶，紗布置于立式壓力蒸汽消毒器中滅菌30 min。滅菌結束后，將培養基倒入培養瓶中，即制成B5培養基。

2.1.2.2 培養香椿幼苗

將香椿種子去殼，除去雜物，用水清洗2次。然后將種子置于燒杯中浸泡，放到25℃恒溫箱中（12 h）。除去漂浮的種子，清洗下層的種子，將其置于盤子中，用濕紗布蓋上，放到25℃恒溫箱中，香椿種子及紗布每天早晚清洗一次，注意觀察種子的發芽狀況，發現種子發芽即可將其種在沙土中，每天澆水，保持沙土表面濕潤，培養香椿幼苗。

2.1.2.3 香椿組織培養

在超凈臺上，挑取生長良好的香椿幼苗，切取其葉片用75%酒精溶液消毒20 s，再用0.1%升汞溶液消毒5 min，無菌水沖洗4次～6次。在超凈臺中將種子接種于B5培養基（含6-芐基嘌呤和萘乙酸）中。

2.1.2.4 觀察組培苗的生長狀況

每天觀察組培苗的生長狀況。

2.2 計算方法

30 d后，統計方案1、方案2香椿組培苗的生愈率、生芽率、死亡率、增殖倍數。

生愈率（%）=（生愈外植體數/接種外植體數）×100

生芽率（%）=（生芽外植體數/接種外植體數）×100

死亡率（%）=（整個莖段褐變但沒有被污染的莖段數目/總的莖段接種數）×100

增殖倍數（%）=（每次繼代培養中增殖后的芽數/接種芽數）×100

2.3 不同濃度6-芐基嘌呤和萘乙酸對香椿組培的影響

培養基中激素的用量，見表1。

表1 培養基中激素的用量Table 1 The medium hormone with scale mg/L

3 結果與結論

3.1 兩種組培方案對照

兩種組培方案對照情況表見表2。

表2 兩種組培方案的對照Table 2 Two kinds of transformation scheme

由表2可知：香椿組織培養的兩種方案均能在30d～40d培育出組培小苗。但是方案1的組培小苗較方案2的成活率高、增值倍數也高。原因可能有以下幾點：

1）方案1的種子提前進行了消毒，培養的小苗即為無菌苗，避免了接種前對香椿幼苗組織的滅菌操作。而方案2在種子長成小苗之后再進行滅菌操作，部分香椿組織被殺死，導致最終組培小苗成活率降低。

2）方案2的滅菌操作比較嚴格，滅菌時間短則污染率比較高，滅菌時間過長則死亡率比較高。

3.2 激素對香椿組織培養的影響

激素對香椿組織培養的影響見表3。

表3 激素對香椿組織培養的影響Table 3 The influence of hormone to cedar tissue culture

由表3可以看出，當采用組號8的激素用量時，香椿組培苗的生芽率最高，而此時的生愈率也比較高。

4 結論

滅菌時間，培養基中激素的用量都會對香椿的組培造成影響。通過實驗研究得知，采用方案1，組號8的激素用量，進行香椿組織培養，香椿組培苗的成活率比較高。