水蒸氣蒸餾法制備板栗花精油及其抑菌活性

趙文越，王雪青，*，邵明輝，宋文軍，趙國強，付慶偉

（1.天津市食品與生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134；2.唐山遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心，河北唐山064300）

植物精油（essential oil）是植物體內(nèi)的由分子量相對較小的簡單化合物組成，具有揮發(fā)性和特有芳香性氣味，可隨水蒸氣蒸餾而得到的油狀液體[1]，按其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為脂肪族、芳香族和萜類3大類化合物以及它們的含氧衍生物，屬于植物次生代謝產(chǎn)物[2]。近年來發(fā)現(xiàn)植物精油除了可作為香精、香水的用途之外，還有殺蟲、抗菌和防腐等生物學(xué)功能，如丁香花、月桂葉[3]、牛至、羅勒[4]、玫瑰[5]、百里香[6]等天然植物精油不僅具有自身獨特的香氣而且還有抵抗各種病菌功能，在崇尚自然的今天，受到人們的特別關(guān)注與重視。

然而植物精油在植物組織中的含量相當稀少，一般在0.5%左右[7]，加之提取材料產(chǎn)量有限，導(dǎo)致精油的價格十分昂貴，限制了天然精油的廣泛應(yīng)用。板栗花作為板栗的副產(chǎn)物，伴隨著板栗種植面積的不斷增加，每年有大量板栗花產(chǎn)出，僅河北省遷西縣就有70萬畝4 000余萬株板栗樹，而一般每平方米樹冠垂直投影面積就有花序254個[8]，但板栗花大多被當作廢物丟棄，不僅污染了環(huán)境，而且造成資源的大量浪費[9]。因此，開展對板栗花的綜合利用與開發(fā)，不僅能解決板栗花污染問題，更能夠提高當?shù)乩蹀r(nóng)的經(jīng)濟收入，因而具有顯著的社會和經(jīng)濟效益。

板栗花香氣怡人，民間有焚燒干板栗花驅(qū)蚊的用法，但是對板栗花精油的相關(guān)研究甚少，本工作擬采用水蒸氣蒸餾法提取板栗花精油并測定其體外抑菌功能，為板栗花綜合開發(fā)利用提供基礎(chǔ)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 板栗花

由河北省唐山市遷西縣板栗研究發(fā)展中心提供，采摘后于避光處晾干，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.1.3 菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：由天津商業(yè)大學(xué)微生物保藏中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Φ24mm揮發(fā)油提取器：天津玻璃儀器廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SN510C立式滅菌鍋：重慶雅馬拓科技有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司等。

1.3 實驗方法

準確稱取50.0 g板栗花與蒸餾水按不同的料液比混合后置于1 000 mL的圓形燒瓶A中，裝置見圖1。

圖1 精油制備示意圖Fig.1 Schematic diagram of the essential oil from Chestnut flower used by steam distillation

分離器B中加入25.00 mL的捕集溶劑正己烷，連接實驗裝置并自冷凝管C向分離器B中添加蒸餾水至溢入蒸餾瓶為止。電熱套加熱，從冷凝管處滴下第一滴液體時計時并保持微沸狀態(tài)，蒸餾不同時間，停止加熱后冷卻20 min，將水相和有機相一起收集稱重后放到-20℃冰箱中冷凍一定時間，待水相完全結(jié)冰后取出，分離出有機相并稱重。同時，不添加板栗花做空白對照組，得到有機相萃取精油前后的質(zhì)量差，即得精油質(zhì)量并計算精油提取率。收集一定量的有機相后經(jīng)無水硫酸鈉干燥過夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即得精油，將得到的精油置于棕色瓶后于4℃冰箱中避光保存[10]。

式中：m為板栗花精油質(zhì)量，g；n為板栗花質(zhì)量，g。

1.4 板栗花精油抑菌作用

1.4.1 抑菌性測定

采用抑菌圈法[11]測定抑菌作用。用打孔器將定性濾紙制成9 mm的圓形紙片，滅菌后備用。在無菌環(huán)境下，吸取已活化的濃度為 1×105CFU/mL～1×106CFU/mL的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和啤酒酵母菌懸液100 μL分別接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基中，涂布均勻，在每個含菌平板上貼上3張已滅菌的濾紙片，濾紙片之間保持一定距離。其中兩個濾紙片各滴加5 μL的板栗花精油，另外一個滴加5 μL正己烷作為對照組，每個菌種平行測定3次。貼完濾紙片后將平板放入生化培養(yǎng)箱，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌放置在37℃條件下培養(yǎng)24 h，啤酒酵母置于28℃條件下培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后選取抑菌圈明顯的平板測定抑菌圈直徑大小，結(jié)果取3次試驗的平均值，比較抑菌效果。

1.4.2 板栗花精油最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）的測定

取1 mL板栗花精油，用正己烷梯度稀釋為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8 μL/mL 一系列不同體積濃度的精油，吸取100 μL供試菌液分別接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基中，涂布均勻，每個平板放3張滅菌濾紙片，每組濾紙片上滴加不同濃度的板栗花精油，共7組。細菌平板放置在37℃條件下培養(yǎng)24 h，真菌平板放置在28℃條件下培養(yǎng)48 h，出現(xiàn)抑菌圈的最小板栗花精油濃度即為最小抑菌濃度（MIC），繼續(xù)培養(yǎng)一個周期，仍存在抑菌圈的板栗花精油濃度則為最低殺菌濃度（MBC）[12]。

1.5 實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理

首先通過單因素試驗研究不同提取工藝參數(shù)對水蒸氣蒸餾提取板栗花精油提取率的影響；在此基礎(chǔ)上，再通過正交試驗優(yōu)化精油的提取工藝。實驗數(shù)據(jù)采用三次實驗平均值加誤差（+s）表示，并用spss16.0軟件分析其顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗花精油提取工藝研究

2.1.1 板栗花破碎度對精油得率的影響

稱取板栗花粉末、1cm短段和整段的板栗花50.0g，按料液比（質(zhì)量體積比g/mL，下同）1∶10加入濃度（質(zhì)量濃度，下同）為50 g/L的氯化鈉溶液500 mL，電熱套加熱，從冷凝管處滴下第一滴液體時計時并保持微沸狀態(tài)，蒸餾2 h，測定板栗花精油得率，結(jié)果見圖2。

圖2 粉碎度對精油得率的影響Fig.2 Effects of the Chestnut flower's size on the yield of essential oils

如圖2所示，手工切斷的板栗花精油得率明顯高于經(jīng)組織搗碎機粉碎成粉末和未進行任何加工的整段的精油得率，故選擇1 cm短段作為最佳破碎度。

2.1.2 蒸餾時間對精油得率的影響

分別蒸餾 1、2、3、4、5 h 之后，測定精油得率，結(jié)果見圖3。

圖3 蒸餾時間對精油得率的影響Fig.3 Effects of distillation time on the yield of essential oils

如圖3所示，當蒸餾時間小于3 h時，精油得率隨著蒸餾時間的增加而明顯增加，并在3 h達到最大，為0.582%，之后精油得率呈略微下降趨勢。

2.1.3 料液比對精油得率的影響

分別選擇料液比 1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL），測定精油得率，結(jié)果見圖4。

如圖4所示，精油得率隨料液比的增大呈現(xiàn)先增大后逐漸減小的趨勢，在料液比為1∶10時達到最大，為0.328%，之后略有下降。

圖4 料液比對精油得率的影響Fig.4 Effects of the ratio of material to solvent on the yield of essential oils

2.1.4 蒸餾液中氯化鈉濃度對精油得率的影響

分別選擇蒸餾液中氯化鈉濃度 0、25、50、75、100 g/L，測定精油得率，結(jié)果見圖5。

圖5 NaCl濃度對精油得率的影響Fig.5 Effects of NaCl concentrations on the yield of essential oils

如圖5所示，精油得率出現(xiàn)隨氯化鈉濃度的增大先增大后減小并趨于穩(wěn)定的趨勢，氯化鈉濃度在50 g/L時達到最大，為0.328%，比未添加氯化鈉的精油得率提高了25%（P＜0.01），比添加100 g/L的氯化鈉提高了 4%（P＜0.01）。

2.2 板栗花精油提取工藝的優(yōu)化

通過以上單因素試驗結(jié)果選擇恰當?shù)膯我蛩厮阶稣辉囼灒瑢φ麴s時間、料液比以及氯化鈉濃度進行條件篩選，以精油得率為指標，選用L9（34）正交表，設(shè)計三因素三水平9個試驗組，見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Levels and factors in the orthogonal design

采用spss16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有水平重復(fù)3次，取平均值。試驗結(jié)果見表2，數(shù)據(jù)分析見表3。

表2 水蒸氣蒸餾提取板栗花精油正交試驗結(jié)果Table 2 Yields of essential oils extracted by steam distillation through orthogonal tests

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Analysis of variance table of orthogonal experiment

由表 2 直觀分析可知：極差比較 RA＞RB＞RC，說明3個因素對精油得率的影響效果大小依次為：蒸餾時間＞料液比＞氯化鈉濃度。由表3可知，蒸餾時間P值（0.000）＜料液比 P 值（0.009）＜0.01＜NaCl濃度 P 值（0.233）與K值分析結(jié)果一致，說明蒸餾時間和料液比是極顯著地影響因素。根據(jù)各因素的K值分析可知，板栗花精油較優(yōu)化提取工藝為A2B2C1，而直觀分析正交試驗9組數(shù)據(jù)中精油得率最高的是A2B2C3為0.618%，由于上述由K值分析的較優(yōu)化組合在正交試驗中不存在，同時也與正交試驗中精油得率最高的組合不一致，因此，此優(yōu)化組合要進行驗證試驗，驗證試驗結(jié)果見表4。

表4 優(yōu)化組合驗證試驗Table 4 Verification tests of optimal technology

由表4可知，3次優(yōu)化組合的精油得率的平均值為0.621%，高于正交試驗組中精油得率最高的A2B2C3，因此，優(yōu)化組合A2B2C1是水蒸氣蒸餾提取板栗花精油的最好提取工藝，即板栗花1 cm短段與濃度為40 g/L氯化鈉的蒸餾液按1∶10的料液比（g/mL）混合，蒸餾3 h，得到的板栗花精油得率最高。水蒸氣蒸餾法提取的板栗花精油常溫下為淡黃色透明，同時伴有濃厚的板栗花氣味的油狀液體。比重計測定其比重為0.687。

2.3 板栗花精油抑菌活性的研究

采用抑菌圈法測定板栗花精油對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的體外抑菌活性，抑菌圈直徑大小見表5。

表5 板栗花精油對3種供試菌的抑菌作用Table 5 Inhibition of the essential oils from Chestnut flower on three kinds of bacteria tested

板栗花精油最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）結(jié)果見表6和表7。

表6 3種供試菌的最低抑菌濃度（MIC）Table 6 Minimum inhibitory concentration of the essential oils from Chestnut flower on the three tested bacteria

表7 三種供試菌的最低殺菌濃度（MBC）Table 7 Minimum bactericidal concentrations of the essential oils from Chestnut flower on the three bacteria tested

由表5可見，板栗花精油對3種供試菌種有不同程度的抑菌作用。比較而言，抑菌能力大小依次為：啤酒酵母＞枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌。由表6和表7可見，板栗花精油對大腸桿菌最低抑菌濃度最大，MIC為125 μL/mL；對枯草芽孢桿菌和啤酒酵母的最低抑菌濃度相同，MIC為62.5 μL/mL；板栗花精油對啤酒酵母的最低殺菌濃度最小，MBC為62.5μL/mL；對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的最低殺菌濃度相同，MBC為125 μL/mL。可見，板栗花精油對啤酒酵母的殺菌效果好于對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的殺菌效果。

3 討論

植物精油是從植物細胞中萃取出的芳香精華成分，提取有水蒸氣蒸餾、溶劑浸提、壓榨、CO2超臨界萃取等多種工藝[13]。水蒸氣蒸餾法由于其設(shè)備簡單、操作容易，成本低、對環(huán)境友好、所得精油質(zhì)量好等特點而被廣泛應(yīng)用。本研究采用水蒸汽蒸餾法，以精油得率為指標，研究了物料破碎度、蒸餾時間、料液比以及蒸餾液中氯化鈉濃度4個因素對其影響的大小。

通常提高植物精油提取率的做法是將物料破碎，增加與蒸餾液的接觸面積，從而使其與蒸餾液充分接觸，水散作用徹底。本實驗采用經(jīng)組織搗碎機粉碎的粉末、1 cm短段和未破碎的整段板栗花3個破碎度研究其對精油得率的影響，結(jié)果顯示，1 cm短段板栗花的提取率最高，粉末的提取率最低，相比，較整段降低了 2.2%（P＜0.05）， 較 1 cm 短段降低了 23%（P＜0.01）（見圖2），其原因可能是板栗花在機械粉碎的過程中，由于受到劇烈摩擦，造成板栗花中的一些熱敏性/揮發(fā)性的物質(zhì)破壞/揮發(fā)，從而導(dǎo)致精油得率的下降。另外，粉末狀的板栗花在水蒸氣蒸餾過程中，隨著蒸餾時間的延長，物料聚集成團，從而發(fā)生爆沸的“沖團”現(xiàn)象[14]，造成部分粉末殘留在蒸餾瓶壁上，進而被燒焦，不但影響精油得率，而且也破壞了揮發(fā)油整體氣味；而整段的板栗花，由于與蒸餾液接觸不充分，一定程度上影響精油得率；1 cm短段的板栗花克服了粉末和整段在蒸餾過程中的不足，得到的精油不僅得率高，且顏色純正、氣味芳香，是最好的破碎度。應(yīng)麗亞[15]等研究物料破碎度對玫瑰花精油得率的影響時發(fā)現(xiàn)，玫瑰花經(jīng)過粉碎后精油得率（0.042%）比未經(jīng)粉碎的（0.063%）降低了50%（P＜0.01），與本實驗結(jié)果一致。

蒸餾時間在水蒸氣蒸餾過程中起著至關(guān)重要的作用，蒸餾時間的長短直接決定著精油得率的大小。本實驗中蒸餾時間是考察的3個因素中對結(jié)果影響最為顯著地（見表3）。精油得率隨蒸餾時間呈現(xiàn)先明顯增大后略微減小的趨勢（見圖3）。這可能是由于在蒸餾初始，精油與水蒸氣形成共沸大量餾出，隨著蒸餾時間的延長，料液中大部分油類組分被蒸出，油水比降低，共沸點升高，精油餾出量減少，精油量基本保持穩(wěn)定。但蒸餾時間越長，精油中水溶性成分損失越多，蒸餾液的溫度也隨之升高，使分離器中液面部分的精油揮發(fā)，導(dǎo)致精油得率下降。何躍君[16]等在研究蒸餾時間對竹葉揮發(fā)油得率的影響時發(fā)現(xiàn)，在前3個小時精油得率明顯上升，之后略微下降并保持穩(wěn)定，與本實驗結(jié)果相一致。

料液比在精油提取過程中也是一個比較重要的影響因素。本實驗發(fā)現(xiàn)，精油得率隨料液比的增大先增大后逐步減小并趨于穩(wěn)定（見圖4），分析原因可能是料液比過小，蒸餾液與板栗花接觸不夠充分，水解作用進行不徹底，勢必影響精油得率；料液比增加，降低溶劑中精油濃度，增加精油與溶劑接觸界面的濃度差，從而提高傳質(zhì)速率，精油得率隨之增加[17]；液料比過大，精油在水中的溶解量隨之增大，導(dǎo)致精油得率降低。同時，加熱時間延長，能耗也會隨之增加，造成不必要的能源浪費，所以，從精油得率和能源節(jié)約角度考慮，1∶10是最佳料液比。

有文獻報道，在蒸餾液中添加一定濃度的氯化鈉，可以提高精油得率[18-19]。本實驗也證實添加一定濃度的氯化鈉，精油得率有明顯的提高。精油得率隨氯化鈉濃度出現(xiàn)先增大后減小的趨勢（見圖5）。其原因可能是由于稀溶液的依數(shù)性改變了純?nèi)芤旱囊恍┪锢硇再|(zhì)[20]，導(dǎo)致溶液的蒸汽壓下降、沸點相應(yīng)升高，精油更容易餾出，得率也隨之升高；也可能是蒸餾液中由于氯化鈉的存在降低了精油中某些成分在水中的溶解度，導(dǎo)致精油得率增加。但氯化鈉濃度過大，精油得率出現(xiàn)下降的趨勢，這可能是由于高鹽溶液的高滲作用，阻止了細胞內(nèi)的精油組分餾出；同時，沸點升高，溶液容易發(fā)生爆沸，也影響精油得率。Rivera[21]等在研究水蒸氣蒸餾提取葛縷子精油時發(fā)現(xiàn)精油得率隨氯化鈉濃度的增高出現(xiàn)先增大后減小的變化趨勢，最佳的氯化鈉濃度為60 g/L。實驗結(jié)果與本實驗趨勢相同。

植物精油化學(xué)成分復(fù)雜，可由50～500種不同的萜烯類、醛類、酯類、醇類等化學(xué)分子組成，在賦予不同的芳香氣味的同時，具有抗細菌、霉菌、病毒等功能，其中萜烯類成分大多有抑菌作用[22]，本研究證實板栗花精油具有一定的抑菌作用，也表現(xiàn)出一定的抑菌選擇性（見表5～表7）。精油的抑菌作用和抑菌選擇性很大程度上取決于精油的活性組分種類。岳曉霞[23]等應(yīng)用平板抑菌圈法考察丁香精油對酵母菌、枯草桿菌和大腸桿菌的抗菌作用，通過測定抑菌圈直徑大小表明，丁香精油對酵母菌的抑制性最強，其次是枯草桿菌和大腸桿菌。實驗結(jié)果與本實驗基本一致。我們用GC-MS對板栗花精油組成成分進行分析，得到19種化合物，其中芳樟醇含量占總精油的9.46%，是主要成分之一。芳樟醇屬于鏈狀萜烯醇類，有報告指出，芳樟醇的抗菌效果是苯酚的五倍，對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大腸桿菌等均具有抗菌活性[23]。吳建挺[24]等研究了天竺葵精油中6種主要成分對6種植物病原真菌的抑菌活性，研究發(fā)現(xiàn)，芳樟醇的抑菌活性最高。可見，芳樟醇是板栗花精油中起抑菌作用的主要成分之一。

植物精油的沸點一般在70℃～300℃之間，其中大部分成分的沸點都集中在180℃～250℃[25]。板栗花精油在抽真空低溫（0.09 MPa，35℃）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)下?lián)p失極小，從而保證了精油的完整度。但是，在水蒸氣蒸餾提取過程中，由于溫度較高，一定程度上會破壞植物中的熱敏性物質(zhì)，造成低沸點成分流失，從而影響精油香氣的完整性。水蒸氣蒸餾提取工藝還有待進一步完善和提高。

4 結(jié)論

水蒸氣蒸餾提取板栗花精油的最佳提取條件為：板栗花1 cm短段，料液比（g/mL）為1∶10，蒸餾液氯化鈉質(zhì)量濃度為40 g/L，蒸餾時間為3 h，精油提取率為（0.621±0.008）%。

板栗花精油對3種供試菌種有不同程度的抑制作用。比較而言，板栗花精油對3種供試菌種的抑菌能力大小依次為：啤酒酵母＞枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌。

板栗花不僅資源豐富、價格低廉而且其精油具有良好的芳香和抑菌防腐性，因此，研究板栗花精油的提取方法和抑菌特性對探索新型食品防腐劑具有重要意義。