南極磷蝦油的氣相色譜指紋圖譜和聚類分析

劉建君，汪勝福，門敬菊，郭忠，馮迪娜，王嘉麒，呂晶

（1.遼寧省大連海洋漁業集團公司技術中心，遼寧大連116113；2.中國人民解放軍第210醫院臨床藥理基地，遼寧大連116011）

南極磷蝦（Antarctic krill）學名 Euphausia superba，屬于動物界節肢動物門，甲殼亞門軟甲綱、磷蝦目、磷蝦科。其富含蛋白質、磷脂、蝦青素、甲殼素、酶等營養成分與活性成分；提取出來的南極磷蝦脂類所含的脂肪酸種類多，且多為不飽和脂肪酸，尤其EPA和DHA含量較高[1]。故而，南極磷蝦近年來引起國內外廣泛關注。隨著消費者需求量的不斷增加，市場上出現的南極磷蝦油品種繁多，魚龍混珠現象時常出現，品質存在較大差異，嚴重損害消費者利益，因此，建立南極磷蝦油產品品質的真偽優劣的分析方法，對于當前南極磷蝦產品的質量控制具有極其重要的意義。中藥指紋圖譜（TCMF）作為中藥及其制劑質量控制的有效手段，已受到了中藥界的廣泛關注，同時也是被國內外廣泛接受的一種有效的中藥材品種鑒定、產地溯源和質量控制手段，而色譜和光譜技術是研究中藥指紋圖譜的兩種主要方法，例如：高效液相色譜、氣相色譜和毛細管電泳等方法已經用于TCMF的研究；色譜TCMF因其具有宏觀、綜合、模糊和非線性等特性[2]，須借助計算機對其進行數據分析，聚類分析和人工神經網絡等數據的解析方法已用于該研究。

在南極磷蝦油甲酯化前處理的基礎上，對10批南極磷蝦油樣品進行指紋圖譜和聚類分析的模式識別研究，建立南極磷蝦油氣相指紋圖譜分析方法，為來自南極洲不同海域、生產國及廠家的南極磷蝦油鑒別與質量評價提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 試樣及試劑

南極磷蝦油：遼寧省大連海洋漁業集團公司；EPA/DHA甲酯標準品（純度≥99%）：美國SIGMA公司。異辛烷、正己烷、甲醇均為色譜純；氫氧化鉀、濃硫酸為分析純；2 mol/L KOH-甲醇溶液、2 mol/L硫酸-甲醇溶液：上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器及設備

7820A型氣相色譜儀（附氫火焰離子化檢測器）：美國 Agilent公司；AL204型電子天平（0.1 mg）：（梅特勒-托利（Metter Toledo）公司；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機：長沙湘智離心機儀器公司。

1.3 色譜條件

色譜柱：HP-88型石英毛細管柱，100 m×0.250 mm×0.20 μm；摸索出最佳色譜程升條件：120 ℃，5 min，5℃/min到 175℃，10 min，5℃/min到210℃，5 min；5℃/min到230℃，10 min；總時長52 min；進樣口溫度：250℃；FID檢測器溫度：270℃；進樣方式：分流，分流比 10∶1；進樣量：1 μL；載氣：高純氮氣（99.999%）。

在以上色譜條件下，33種標準物質成分實現基線分離，保留時間精密度RSD＜1.0%，各組分峰面積精密度RSD＜1.5%；其余4種組分分離度小于1.5，即：γ-亞麻酸與花生酸保留時間在32.600 min（RSD為0.78%）；二十二碳酸與二十碳三烯酸保留時間在37.331 min（RSD為0.67%），氣相色譜圖詳見圖1。

圖1 37種脂肪酸甲酯混合標準品在HP-88型毛細管柱上的氣相色譜圖Fig.1 37 kinds of mixed fatty acid methyl esters standards in GC using HP-88 capillary column

1.4 方法學考察

1.4.1 精密度試驗

取同一份供試品溶液，連續進樣5次，檢測指紋圖譜。結果表明，其相對保留時間RSD＜1.0%，主要共有峰相對峰面積比值的RSD＜1.0%，符合指紋圖譜要求。

1.4.2 重現性試驗

取同一批樣品5份，制備供試品溶液，檢測指紋圖譜。結果表明，其相對保留時間RSD＜1.0%，主要共有峰相對峰面積比值的RSD＜2.0%，符合指紋圖譜要求。

1.4.3 穩定性試驗

取同一份供試品溶液，分別在 0、2、6、18、12 h 檢測指紋圖譜。結果表明，其相對保留時間RSD＜1.0%，主要共有峰峰面積的RSD＜2.0%，符合指紋圖譜要求。

1.4.4 共有特征峰的篩選

以L20130729E01批南極磷蝦油為參照對象，進行特征峰篩選，篩選結果如下：確定出13個共有特征峰，分別是：肉豆蔻酸、十五碳酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、組分D、硬脂酸、油酸、組分E、亞油酸、α-亞麻酸、二十一碳酸、EPA、DHA。見圖2和表1。

圖2 L20130729E01批南極磷蝦油的氣相色譜圖Fig.2 The gas chromatogram of L20130729E01 batch antarctic krill oil sample

表1 南極磷蝦油13個特征峰的信息Table 1 Antarctic krill oil 13 mark peaks information

通過在HP-88毛細管柱及以上優化色譜條件，達到較好的組分峰分離效果，從而，選出13個共有特征組分峰，進行以下數據統計，10批南極磷蝦油甲酯化樣品歸一化法各組分的百分面積信息，見表2。

2 色譜指紋圖譜相似度評價及聚類分析

2.1 中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（A版）評價南極磷蝦油的相似度

將10批南極磷蝦油的氣相色譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（國家藥典委員會2004A版）》，通過多點校正法對色譜峰進行自動匹配，生成南極磷蝦油的色譜指紋圖譜共有模式，見圖3。

在分析檢驗模式下，以L20130729E01批南極磷蝦油樣品圖譜作為參照圖譜，進行相似度計算與評價，結果見表3。

相似度結果情況：批號N20130724E01樣品相似度為0.906，相似度最低，其次是N20130724E02樣品為0.953，其余8批樣品相似度均大于0.955；圖譜的相似度評價作為一種系統性、綜合性的判定指標，為南極磷蝦油的品質控制提供了一個有效的參考方法。

表2 10批南極磷蝦油樣品面積歸一化法各組分的數據Table 2 The peak area normalization method of each component data about 10 batches of antarctic krill oil

表3 10批南極磷蝦油的GC指紋圖譜相似度評價Table 3 The GC Fingerprint Similarity Evaluation of 10 batches of antarctic krill oil

圖3 10批南極磷蝦油的GC指紋圖譜Fig.3 The GC fingerprints of 10 batches of antarctic krill oil

2.2 基于脂肪酸成分的系統聚類分析鑒別

本實驗采用SSPS19.0聚類分析軟件包，包括系統聚類、模糊聚類、圖論聚類等多種聚類分析方法；本文選擇系統聚類的最近鄰元素、組間距離法（Betweengroups linkage）和歐氏距離平方（Squared euclindean distance）處理各批次樣品的色譜數據，進行聚類分析，其分析結果見表4和圖4。

表4 10批南極磷蝦油樣品系統聚類分析數據Table 4 The clustering analysis data about the 10 batches of antarctic krill oil

圖4 10批南極磷蝦油樣品系統聚類分析圖Fig.4 The figure of genealogied cluster analysis about the 10 batches of antarctic krill oil

通過最近鄰元素、組間距離法的聚類分析可以看出，10批樣品的結果如下：組間距離法的結果：當歐氏距離d大于13時，可分為三類，即：1、4與5為一類（d≤2）；7、8、9、10 為一類（5＜d＜10），2、3、6 聚為一類（13＜d≤15）。因此，L20130729E01、X-20130528E01、X-20130707E01這3批聚為一類（d≤2），而且d值最小，這說明所用南極磷蝦原料為2011年與2012年的鮮品凍蝦，貯存時間較長，且接近；X-20130812E01、F20130807E01、F20130808E01、F20130812E01 四批聚為一類（5＜d＜10），其中三者甚為一致，說明這 3 批南極磷蝦油均為2013年的鮮品凍蝦原料提取，另外X-20130812E01這批明顯有一定區別，是南極磷蝦干粉醇提得到的磷蝦油；N20130724E02、N20130724E01、X-20130807E01這3批聚為一類（13＜d≤15）；說明N20130724E02、N20130724E01批次南極磷蝦油提取工藝與其他8批次提取工藝有所不同；但通過X-20130807E01這批精提工藝的樣品可以看出，N20130724E02和N20130724E01兩批磷蝦油很接近。

4 結論

綜上看來，基于HP-88型石英毛細管柱的氣相色譜信息，通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（A版）》與IBM的SPSS19.0權威統計學軟件共同對南極磷蝦油的13個共有特征組分峰進行分析，可以看出：通過比較對照品的方法，已確定的南極磷蝦油指紋圖譜中13個共有的指紋峰中6個不飽和脂肪酸成分在南極磷蝦油指紋圖譜中的峰面積占總指紋峰峰面積的43%以上，其中n-3多不飽和脂肪酸（EPA、DHA）達20%以上，均具有很強的代表性和特征性。

南極磷蝦油經過指紋圖譜法的測定后，從相似度的計算和聚類分析結果可以看出，不同工藝和原料貯存時間長短，對南極磷蝦油品質上有一定的差別。隨著今后的研究，樣品量逐步增多，在HP-88型石英毛細管柱的色譜信息量加大，可以建立南極磷蝦油氣相色譜指紋圖譜鑒定信息系統。

指紋圖譜是現代分析中常用的手段之一，它能夠較充分得到某提取物質獨特的信息[3]。系統聚類分析作為化學計量學方法的一種，能夠找到隱藏在眾多共性下的差異，對提取的數據進行充分的多元分析。二者結合起來使用為南極磷蝦油來源的識別及質量評價提供了新的思路和模式；將指紋圖譜法與相似度和聚類分析相結合來綜合評價南極磷蝦油質量，其判斷結果更科學、更全面、更符合實際情況；從而為南極磷蝦的規范化捕撈、南極磷蝦來源的認證和生產過程控制及南極磷蝦油產品真偽優劣的甄別提供技術參考。