6種黃酮類化合物清除超氧陰離子自由基能力及其構效關系

趙靜+李玉琴(等)

[摘要] 目的 測定槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素和柚皮苷對超氧陰離子自由基（O-2·）的清除能力，探討6種化合物清除O-2·的構效關系。 方法 采用流動注射鄰苯三酚-魯米諾化學發光法測定6種化合物對O-2·的清除率，采用IC50來衡量樣品對自由基的清除能力。以維生素C為陽性對照。 結果 槲皮素、根皮苷、楊梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素對O-2·的抑制率分別為0.1547、0.2048、0.4623、0.6157、1.8098、2.9798 μmol/L。6種化合物清除O-2·能力從大到小依次為槲皮素、根皮苷、楊梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素，均高于維生素C（4.9586 μmol/L）。 結論 6種黃酮類化合物結構與清除O-2·能力密切相關：酚羥基是其清除O-2·的必要基團，B環的羥基化程度、羥基的數目和位置，C環開環后形成的羥基和雙鍵，A環取代基的位置、數目以及化合物的空間結構，均是影響抗氧化活性的重要因素。

[關鍵詞] 6種黃酮類化合物；超氧陰離子自由基；清除率；構效關系

[中圖分類號] O657.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）10（b）-0007-05

Study of 6 flavonoids compounds for the scavenging superoxide anion free radical ability and the structure-activity relationships

ZHAO Jing1 LI Yuqin2▲ WANG Fangqiao2 JIA Baoxiu2 LIU Caihong2 WANG Renliang3

1.Taishan Sanatorium of Shandong Province， Shandong Province， Tai'an 271000， China； 2.School of Pharmacy， Taishan Medical University， Shandong Province， Tai'an 271016， China； 3.School of Chemical Engineering， Taishan Medical University， Shandong Province， Tai'an 271016， China

[Abstract] Objective To study the scavenging superoxide anion free radical （O-2·） ability of quercetin， myricetin， phloridzin， naringin， puerarin and proanthocyanidins， and to explore their structure-activity relationships for removing O-2·. Methods The scavenging O-2· ability was determined by flow injection analysis-pyrogallol-chemiluminescence. IC50 was calculated and used to examine the scavenging free radical ability. Vitamin C was used as positive control. Results The results showed that IC50 of quercetin， myricetin， phloridzin， naringin， puerarin and proanthocyanidins were 0.1547， 0.2048， 0.4623， 0.6157， 1.8098， 2.9798 μmol/L， respectively. The scavenging O-2· ability of the 6 compounds were arranged as quercetin， myricetin， phloridzin， naringin， puerarin and proanthocyanidins， and all were higher than Vitamin C （4.9586 μmol/L）. Conclusion The scavenging O-2· ability of 6 flavonoids compounds have been closely related to their structures： phenolic hydroxyl is the necessary group for removing the O-2·， the degree of hydroxylation， the number and location of hydroxyl of B ring， the hydroxyl and double bond of the formatting of C ring opening， substituent position， number and spatial structure of A ring， are all important influencing factors of antioxidant activity.

[Key words] Six flavonoids compounds； Superoxide anion free radical； The scavenging ability； The Structure-activity relationships

生物體在自身的新陳代謝過程中會產生大量的活性氧自由基，超氧陰離子自由基（O-2·）是具有代表性的活性氧自由基之一。研究表明，許多疾病，如癌癥、循環系統疾病、代謝失調、光損傷、毒物侵害等都與人體內的自由基有關。O-2·的破壞作用是通過一系列鏈式反應實現的，可引發組織的不斷氧化消耗，其結果是破壞性和不可逆轉的，只能通過加入抗氧化劑終止鏈反應。因此，尋找能夠清除活性氧自由基的抗氧化劑具有十分重要的意義。

眾多研究表明，天然黃酮類化合物有抗突變、抗腫瘤、抗炎、治療心血管疾病等廣泛生物學活性，其中最為重要的是它能減少自由基的形成和清除自由基[1-5]。然而黃酮類化合物種類繁多，其清除自由基的功效與每種化合物的具體結構有關，因而不同的物質可能對不同體系的抗氧化作用不同，對不同類型的自由基和組織也存在選擇性作用[6-10]。了解黃酮類化合物抗氧化、清除自由基的構效關系，對于通過化學修飾的方法有效改變黃酮類化合物現有結構弱點，增強其生物學活性，增大其實用價值有重要意義。

筆者通過體外實驗研究槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素和柚皮苷6種黃酮化合物對O-2·的清除能力，探討6種化合物抗氧化作用的構效關系。

1 儀器與試藥

MPI-B型多功能化學發光檢測器（西安瑞邁分析儀器有限公司），自動電位滴定儀ZD-2型。槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素、柚皮苷和維生素C對照品購自中國藥品生物制品檢定所；鄰苯三酚、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉（天津市博迪化工有限公司）；魯米諾（上海藍季科技發展有限公司）。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

魯米諾儲備液（1.0×10-2 mol/L）：稱取適量魯米諾，用0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，并定容至50 mL棕色容量瓶，冰箱中儲存。

維生素C溶液（1.0×10-2 mol/L）：稱取適量維生素C用水溶解，并定容至100 mL容量瓶中。

槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素、柚皮苷儲備液（1.0×10-2 μg/mL）：用50%乙醇配制。

鄰苯三酚（0.01 mol/L）：用0.01 mol/L HCl配成儲備液，使用前用水稀釋。

Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液（0.01 mol/L）：臨用前新鮮配制。

2.2 流動注射化學發光法

實驗管路見圖1。蠕動泵分別泵入鄰苯三酚溶液S、魯米諾-碳酸鹽緩沖液C和空白或被測物R，在反應器中混合并反應，產生發光信號。

P：蠕動泵；V：換向閥；F：檢測器；W：廢液；PTM：光電倍增管；HV：負高壓；PC：記錄儀

圖1 流動注射化學發光儀示意圖

2.3 流動注射化學發光法實驗程序編寫

為了使體系發光穩定且發光較強，將增益設為3，高壓為600 V。為了減少泵管的損耗，將主泵速度設為30 r/min，副泵速度設為30 r/min。試驗程序見表1。

表1 超氧陰離子自由基試驗程序

注：L：左，R：右；Y：是；F：向前

2.4 O-2·檢測體系的優化

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產生O-2·，O-2·與魯米諾發生氧化反應，產生一個電子激發態的中間物，當其返回基態時，可產生化學發光現象，反應體系中O-2·的量可以間接地用化學發光強度I來表示[11]。以發光的穩定性、重現性以及強度為依據分別考察緩沖液pH、鄰苯三酚和魯米諾濃度對發光強度的影響。當緩沖液pH=10，鄰苯三酚和魯米諾濃度分別為0.005、0.06 mmol/L時，體系的穩定性、重現性以及發光強度最佳。見圖2。

2.5 抗氧化測定及抑制率計算

在最佳條件下，分別測定空白溶液的發光強度（I0）和一系列加入樣品溶液后體系的發光強度（IT）。根據發光信號的降低值（I0-IT），可定量分析6種化合物與維生素C清除O-2·的能力，可計算出加入不同濃度溶液后抑制發光的程度，即對自由基的抑制率：

抑制率=（I0-IT）/I0×100%

以發光抑制率為縱坐標，樣品液濃度為橫坐標，繪出發光抑制率曲線，并計算出發光抑制率為50%時的濃度IC50，用來衡量樣品對自由基的清除能力。IC50值越小，表明樣品清除自由基能力越強。每個樣品平行測定6次。

2.6 6種化合物對O-2·的清除能力

測定不同濃度槲皮素、根皮苷、楊梅素、原花青素、葛根素、柚皮苷和維生素C溶液對發光強度的影響，O-2·的清除率，計算發光抑制率，并繪制發光抑制率曲線。見圖3。

1.槲皮素；2.根皮苷；3.楊梅素；4.柚皮苷；5.葛根素；6.原花青素；7.維生素C

圖3 6種化合物和維生素C對O-2·的清除作用

由圖3可知，6種黃酮類化合物和維生素C溶液對O-2·的清除效果均呈現出劑量依賴關系，即隨著溶液濃度的增大，其對O-2·的清除效果也增強。槲皮素、根皮苷、楊梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素 6種化合物和維生素C溶液對O-2·的清除率IC50值分別為0.1547、0.2048、0.4623、0.6157、1.8098、2.9798、4.9586 μmol/L。提示對O-2·的清除能力大小依次為槲皮素、根皮苷、楊梅素、柚皮苷、葛根素、原花青素、維生素C。

3 討論

3.1 黃酮類化合物結構

黃酮類化合物是以2-苯基色原酮為母核的一類物質，兩個芳環（A、B環）之間以一個三碳鏈相連，具有C6-C3-C6基本構型，將三個環分別標為A、B、C（圖4）。其母核上帶有羥基、甲氧基、羥氧基等取代基分別形成各種黃酮類化合物，以游離苷原或以與糖結合的苷類等形式存在于許多植物中。黃酮類各環上的羥基活性相差較大：B環的酚羥基活性最高；當C環上羥基和不飽和雙鍵相連時，C環也具有較強的抗氧化活性，A環的酚羥基活性最弱。

3.2 B環與抗氧化性

B環上的羥基化程度是抗氧化活性的一個主要因素，含鄰位酚羥基黃酮類化合物與自由基反應形成了較為穩定的共軛半醌式自由基，從而中斷游離自由基的鏈式反應，所以具有較強的抗氧化性。B環中的鄰二酚羥基對黃酮類化合物的抗氧化活性起主要作用，具有強抗氧化活性的這類物質一般都有3′，4′-鄰苯二酚結構。本實驗中，槲皮素和楊梅素具有3′，4′-鄰苯二酚結構，它們在6種化合物中抗氧化活性較強。羥基的位置和數目與抗氧化活也有密切的關系，羥基數目和位置的差異，使化合物表現出不同程度的抗氧化活性。本實驗IC50值表明，槲皮素抗氧化活性遠大于楊梅素，故可推測楊梅素B環5′位羥基抑制其抗氧化活性。

3.3 C環與抗氧化性

黃酮化合物C環的3位羥基是很重要的結構，3位上的羥基與2，3位間的雙鍵可以發生異構化，變成二酮式，此結構在二位上產生具有較高活性的-CH-基團，不飽和C環延長了A、B環的共軛體系，使苯氧自由基更加穩定，增強了抗氧化活性。本實驗中，槲皮素、楊梅素具有此結構，因此兩者具有很強的抗氧化活性。通過比較根皮苷和柚皮苷的結構發現，根皮苷C環開環且兩種化合物氧糖苷的位置不同。實驗結果表明，根皮苷的抗氧化活性遠大于柚皮苷，因此推測C環的開環結構和糖苷鍵的位置能夠影響黃酮類化合物的抗氧化活性。一般認為，7位氧糖苷對活性不利，C環開環結構有助于增強化合物的抗氧化活性[12]。

3.4 A環與抗氧化性

天然黃酮類化合物A環的羥基大多處在C5和C7，不像B環那樣，一般均具有鄰二酚羥基。過去認為，A環不易被氧化，因而不直接參與抗氧化反應，但近來研究表明，A環也可發揮抗氧化作用[13]。同時，A環上的5，7位羥基有利于抗氧化活性，本實驗中葛根素只有7位羥基，沒有5位羥基，其抗氧化活性較弱。有實驗表明，7位羥基在4′羥基存在時可以提高抗氧化活性[14]，本實驗所研究的化合物均具有這種結構，IC50值表明它們的抗氧化活性均強于維生素C，故均具有很強的抗氧化活性。本實驗表明，柚皮苷的抗氧化活性大于葛根素，因其A環上2′位多了一個多羥基環氧化物，故可推測A環上的取代基會影響黃酮類化合物的抗氧化活性[15-17]。

3.5 空間結構與抗氧化性

原花青素多以聚合物形式存在，本實驗表明其抗氧化活性弱于其他5種黃酮類化合物，推測其空間結構影響了抗氧化活性。

本實驗采用流動注射化學發光法測定6種黃酮類化合物清除O-2·的能力，此方法靈敏度高，快速測定，操作簡單和重現性好，可用于評價物質的抗氧化活性及抗自由基活性藥物的研究和篩選。研究結果表明，6種黃酮類化合物抗氧化活性與其結構密切相關，酚羥基是起抗氧化作用的必要基團，B環的羥基化程度、羥基的數目和位置，C環開環后形成的羥基和雙鍵，A環取代基的位置數目以及化合物的空間結構，均是影響抗氧化活性的重要因素。

[參考文獻]

[1] 陳芝蕓，李劍霜，蔣劍平.胡柚皮黃酮對非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝組織SIRT1/PGC-1α通路的影響[J].中國中藥雜志，2014，39（1）：100-104.

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（收稿日期：2014-07-12 本文編輯：衛 軻）

3.3 C環與抗氧化性

黃酮化合物C環的3位羥基是很重要的結構，3位上的羥基與2，3位間的雙鍵可以發生異構化，變成二酮式，此結構在二位上產生具有較高活性的-CH-基團，不飽和C環延長了A、B環的共軛體系，使苯氧自由基更加穩定，增強了抗氧化活性。本實驗中，槲皮素、楊梅素具有此結構，因此兩者具有很強的抗氧化活性。通過比較根皮苷和柚皮苷的結構發現，根皮苷C環開環且兩種化合物氧糖苷的位置不同。實驗結果表明，根皮苷的抗氧化活性遠大于柚皮苷，因此推測C環的開環結構和糖苷鍵的位置能夠影響黃酮類化合物的抗氧化活性。一般認為，7位氧糖苷對活性不利，C環開環結構有助于增強化合物的抗氧化活性[12]。

3.4 A環與抗氧化性

天然黃酮類化合物A環的羥基大多處在C5和C7，不像B環那樣，一般均具有鄰二酚羥基。過去認為，A環不易被氧化，因而不直接參與抗氧化反應，但近來研究表明，A環也可發揮抗氧化作用[13]。同時，A環上的5，7位羥基有利于抗氧化活性，本實驗中葛根素只有7位羥基，沒有5位羥基，其抗氧化活性較弱。有實驗表明，7位羥基在4′羥基存在時可以提高抗氧化活性[14]，本實驗所研究的化合物均具有這種結構，IC50值表明它們的抗氧化活性均強于維生素C，故均具有很強的抗氧化活性。本實驗表明，柚皮苷的抗氧化活性大于葛根素，因其A環上2′位多了一個多羥基環氧化物，故可推測A環上的取代基會影響黃酮類化合物的抗氧化活性[15-17]。

3.5 空間結構與抗氧化性

原花青素多以聚合物形式存在，本實驗表明其抗氧化活性弱于其他5種黃酮類化合物，推測其空間結構影響了抗氧化活性。

本實驗采用流動注射化學發光法測定6種黃酮類化合物清除O-2·的能力，此方法靈敏度高，快速測定，操作簡單和重現性好，可用于評價物質的抗氧化活性及抗自由基活性藥物的研究和篩選。研究結果表明，6種黃酮類化合物抗氧化活性與其結構密切相關，酚羥基是起抗氧化作用的必要基團，B環的羥基化程度、羥基的數目和位置，C環開環后形成的羥基和雙鍵，A環取代基的位置數目以及化合物的空間結構，均是影響抗氧化活性的重要因素。

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（收稿日期：2014-07-12 本文編輯：衛 軻）

3.3 C環與抗氧化性

黃酮化合物C環的3位羥基是很重要的結構，3位上的羥基與2，3位間的雙鍵可以發生異構化，變成二酮式，此結構在二位上產生具有較高活性的-CH-基團，不飽和C環延長了A、B環的共軛體系，使苯氧自由基更加穩定，增強了抗氧化活性。本實驗中，槲皮素、楊梅素具有此結構，因此兩者具有很強的抗氧化活性。通過比較根皮苷和柚皮苷的結構發現，根皮苷C環開環且兩種化合物氧糖苷的位置不同。實驗結果表明，根皮苷的抗氧化活性遠大于柚皮苷，因此推測C環的開環結構和糖苷鍵的位置能夠影響黃酮類化合物的抗氧化活性。一般認為，7位氧糖苷對活性不利，C環開環結構有助于增強化合物的抗氧化活性[12]。

3.4 A環與抗氧化性

天然黃酮類化合物A環的羥基大多處在C5和C7，不像B環那樣，一般均具有鄰二酚羥基。過去認為，A環不易被氧化，因而不直接參與抗氧化反應，但近來研究表明，A環也可發揮抗氧化作用[13]。同時，A環上的5，7位羥基有利于抗氧化活性，本實驗中葛根素只有7位羥基，沒有5位羥基，其抗氧化活性較弱。有實驗表明，7位羥基在4′羥基存在時可以提高抗氧化活性[14]，本實驗所研究的化合物均具有這種結構，IC50值表明它們的抗氧化活性均強于維生素C，故均具有很強的抗氧化活性。本實驗表明，柚皮苷的抗氧化活性大于葛根素，因其A環上2′位多了一個多羥基環氧化物，故可推測A環上的取代基會影響黃酮類化合物的抗氧化活性[15-17]。

3.5 空間結構與抗氧化性

原花青素多以聚合物形式存在，本實驗表明其抗氧化活性弱于其他5種黃酮類化合物，推測其空間結構影響了抗氧化活性。

本實驗采用流動注射化學發光法測定6種黃酮類化合物清除O-2·的能力，此方法靈敏度高，快速測定，操作簡單和重現性好，可用于評價物質的抗氧化活性及抗自由基活性藥物的研究和篩選。研究結果表明，6種黃酮類化合物抗氧化活性與其結構密切相關，酚羥基是起抗氧化作用的必要基團，B環的羥基化程度、羥基的數目和位置，C環開環后形成的羥基和雙鍵，A環取代基的位置數目以及化合物的空間結構，均是影響抗氧化活性的重要因素。

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[6] 申玉莉，劉宏，喻晶.結構與非結構因素對黃酮類化合物抗氧化活性作用的影響[J].中國藥房，2013，24（7）：660.

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（收稿日期：2014-07-12 本文編輯：衛 軻）