血管緊張素Ⅱ受體及其信號轉導關鍵酶在宮頸癌中的表達

于娟++高國蘭（等）

[摘要] 目的 探討血管緊張素Ⅱ-1型受體（AT1R）和血管緊張素Ⅱ-2型受體（AT2R）及其信號轉導關鍵酶在宮頸癌中的表達。 方法 收集2013年3月～2014年2月河南省人民醫院及中國醫科大學航空總醫院手術切除正常宮頸組織47例（對照組）、宮頸上皮內瘤變（CIN）組織36例（CIN組）及65例宮頸癌組織標本（宮頸癌組）。采用實時熒光定量PCR檢測AT1R和AT2R mRNA水平；蛋白質印記法檢測AT1R和AT2R蛋白表達水平。激活AT1R，測定酪氨酸激酶（PTK）活性；激活AT2R，測定胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）活性。 結果 與對照組比較，CIN組及宮頸癌組AT1R、AT2R的mRNA水平以及蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。激活AT1R后，CIN組與宮頸癌組的PTK活性與對照組比較均明顯升高[（64.00±16.23），（89.00±20.76）比（50.00±12.16）]，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）；與CIN組比較，宮頸癌組進一步升高（P < 0.05）。激活AT2R后，CIN組和宮頸癌組的cPLA2活性與對照組比較均明顯升高[（137.00±19.72）、（181.00±30.83）比（104.00±21.46）]，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）；與CIN組比較，宮頸癌組進一步升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 AT1R、AT2R與宮頸癌的發生發展密切相關，有望成為宮頸癌潛在的診斷和治療靶點。

[關鍵詞] 血管緊張素Ⅱ-1型受體；血管緊張素Ⅱ-2型受體；宮頸癌；信號轉導

[中圖分類號] R711.74 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）10（b）-0024-04

Expressions of Angiotensin Ⅱ receptor and the key signal transduction enzymes in the cervical cancer

YU Juan1 GAO Guolan1 YU Liqun1▲ WU Qianfeng1 ZHANG Juxin2

1.Department of Gynecology， Aviation General Hospital of China Medical University， Beijing 100012， China； 2.Department of Gynecology and Obstetrics， Henan Provincial People's Hospital， He'nan Province， Zhengzhou 450003， China

[Abstract] Objective To investigate the expressions of angiotensin Ⅱ receptor （ATR） and the key signal transduction enzymes in cervical cancer. Methods Uterine cervical tissue specimens from the patients who treated in the Henan Province People's Hospital and Aviation General Hospital of China Medical University from March 2013 to February 2014 were collected. There were 47 cases of normal cervix （control group）， 36 cases of cervical intraepithelial neoplasia （CIN group） and 65 cases of cervical cancer （cervical cancer group）. The levels of AT1R and AT2R mRNA were detected by real-time quantitative PCR and the protein expressions of AT1R and AT2R were determined by Western blot analysis. The activities of protein tyrosine kinase （PTK） were measured when the AT1R was activated by angiotensin Ⅱ. The activities of cytosolic phospho1ipase A2 （cPLA2） were detected when the AT2R was activated. Results The levels of AT1R and AT2R mRNA in the CIN group and cervical cancer group were significantly increased compared with the control group. The levels of AT1R and AT2R protein expression in the CIN group and cervical cancer group were significantly increased compared with the control group （P < 0.05 or P < 0.01）. The activities of PTK were increased significantly in the CIN group and cervical cancer group compared with control group [（64.00±16.23） vs （50.00±12.16）， P < 0.05； （89.00±20.76） vs （50.00±12.16）， P < 0.01]. The activities of cPLA2 were increased significantly in the CIN group and cervical cancer group compared with control group [（137.00±19.72） vs （104.00±21.46）， （181.00±30.83） vs （104.00±21.46）]， the differences of two were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）， compared with the CIN group， cervical cancer group was further increased， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion AT1R and AT2R are closely associated with the development of cervical cancer and may become candidate markers for early diagnosis of cervical cancer and new targets for therapy.

[Key words] Angiotensin Ⅱ type 1 receptor； Angiotensin Ⅱ type 2 receptor； Cervical cancer； Signal transduction

宮頸癌是嚴重威脅女性生命健康的婦科惡性腫瘤之一，發病確切原因目前仍不清楚。血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）是血管緊張素最重要的組成部分，與血管緊張素Ⅱ-1型受體（AT1R）和血管緊張素Ⅱ-2型受體（AT2R）結合，調節血壓和電解質平衡，并且在腫瘤血管生成以及腫瘤細胞的增殖、遷移、浸潤中起重要作用。血管緊張素受體（ATR）Ⅱ在宮頸癌細胞的表達及意義并未見系統研究。因此，本研究采用實時熒光定量PCR及蛋白質印記法分別檢測不同臨床分期的宮頸癌患者癌組織中ATR的表達，探討ATR與宮頸癌發病的相關性，為找尋宮頸癌的有效治療方法提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年3月～2014年2月河南省人民醫院及中國醫科大學航空總醫院手術切除的病變宮頸標本101例。其中宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）36例（CIN組），年齡29～73歲，平均（47.7±11.6）歲；按2003年WHO腫瘤組織學分級標準，CINⅠ 10例，CINⅡ 14例，CINⅢ 12例。宮頸癌65例（宮頸癌組），年齡34～71歲，平均（49.5±10.1）歲，按2009年國際婦產科聯盟的臨床分期標準，Ⅰ期24例，Ⅱ期27例，Ⅲ期9例，Ⅳ期5例。選取同期因子宮肌瘤行全子宮切除的正常宮頸組織47例作為對照組，年齡42～66歲，平均（46.7±5.9）歲。所有患者均簽署知情同意書，且經過醫院倫理委員會審查通過。所有患者均未接受化療、放療或其他針對腫瘤的治療，無嚴重心肺疾病、肝炎及伴發其他臟器惡性腫瘤，臨床及病理資料完整。三組一般資料比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 試劑及藥品

Trizol試劑購自于美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒A3500購自美國Promega公司；SYBR熒光實時PCR試劑盒購自日本Katara生物公司；鼠抗人AT1R、鼠抗人AT2R和羊抗鼠IgG-HRP二抗均購自Santa Crus公司。AngⅡ、PDl23319、PTK活性檢測試劑盒購自美國Sigma公司，磷脂酶A2（cPLA2）活性檢測試劑盒購自美國Cayman公司，氯沙坦購自美國默沙東公司。其他試劑均為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量PCR檢測AT1R、AT2R mRNA水平 提取各組樣本采用Trizol法提取總RNA，應用反轉錄試劑盒（A3500）將總RNA（2 μg）反轉錄為cDNA（20 μL體系）及實時定量PCR，引物設計見表1。采用Livak等[1]報道的2-ΔΔCt方法計算mRNA表達水平。

表1 引物序列表

1.3.2 Western blot檢測AT1R、AT2R蛋白表達 組織經處理后，按文獻方法裂解組織提取蛋白，BCA法進行蛋白定量，取100 μg蛋白加入2×十二烷基硫酸鈉（SDS）凝膠加樣緩沖液中，100℃加熱10 min以使蛋白變性。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離蛋白，再將其轉移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，根據抗體說明書加入稀釋的一抗鼠抗人AT1R、鼠抗人AT2R，4℃孵育8 h，TBST洗膜3次，按1∶2000加入辣根過氧化物酶藕聯熒光二抗，室溫避光孵育1 h，TBST避光洗膜3次，采用Odyssey 13.0掃描儀對硝酸纖維素膜進行掃描成像，采用Quantity one軟件對圖像進行面積灰度值計算，以目的條帶與內參條帶灰度比值做半定量分析。

1.3.3 酪氨酸激酶活性測定 取各組組織剪成重約100 mg，加入AngⅡ（1×10-8 mol/L）、AT2R抑制劑PDl23319（5×10-7 mol/L），在持續通入95%O2和5%CO2混合氣體的Krebs液中37℃搖床環境溫育15 min，嚴格按照試劑盒操作說明書進行PTK活性測定。每一標本分別測2次，取平均值。

1.3.4 cPLA2活性測定 取各組組織剪成重約100 mg，加入AngⅡ、AT1R抑制劑氯沙坦（1×10-7 mol/ L），在持續通入95%O2和5%CO2混合氣體的Krebs液中，37℃搖床環境溫育15 min，嚴格按試劑盒說明書進行cPLA2活性測定。每一標本分別測2次，取其平均值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間比較采用Bonferroni t檢驗（方差齊）或Dunn's多組檢驗（方差不齊），以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組AT1R、AT2R mRNA水平比較

與對照組相比較，CIN組（1.35±0.13）及宮頸癌組（1.74±0.21）AT1R的mRNA水平均明顯升高，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）；與CIN組相比較宮頸癌組AT1R的mRNA水平均明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。與對照組相比較，CIN組（1.55±0.19）及宮頸癌組（2.40±0.27）AT2R的mRNA水平均明顯升高，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）；與CIN組比較，宮頸癌組AT2R mRNA水平均明顯升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見圖1。

2.2 三組AT1R、AT2R蛋白表達水平比較

與對照組AT1R的蛋白表達水平（0.89±0.15）比較，CIN組（1.60±0.22）及宮頸癌組（2.61±0.28）均明顯升高，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）；與CIN組比較，宮頸癌組AT1R的蛋白表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。與對照組AT2R的蛋白表達水平（0.71±0.12）比較，CIN組（1.92±0.27）及宮頸癌組（3.42±0.33）均明顯升高，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）；與CIN組比較，宮頸癌組AT2R的蛋白表達水平均明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖2。

與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與CIN組比較，#P < 0.05，##P < 0.01

圖2 AT1R、AT2R 蛋白表達水平比較

2.3 酪氨酸激酶活性

激活AT1R后，CIN組與宮頸癌組的PTK活性與對照組相比均明顯升高，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），與CIN組比較，宮頸癌組進一步升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。激活AT2R后，CIN組與宮頸癌組的cPLA2活性與對照組相比均明顯升高，差異均有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01），與CIN組比較，宮頸癌組進一步升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

表2 酪氨酸激酶與磷脂酶A2表達水平變化[mmol/（min·mg），x±s]

注：與對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與CIN組比較，#P < 0.05；CIN：宮頸上皮內瘤變；PTK：酪氨酸激酶；cPLA2：磷脂酶A2

3 討論

宮頸癌是嚴重威脅女性生命健康的婦科惡性腫瘤之一，病死率居女性腫瘤死亡第2位，近年我國女性宮頸癌發病率逐年上升，并且呈年輕化的趨勢[2-3]。宮頸癌的發生與許多因素有關，但目前我們對宮頸癌發病的具體分子機制尚缺乏全面和深入的了解。AngⅡ作為一種細胞效應因子，主要通過與其受體結合發揮生物學效應。ATR主要分為AT1R、AT2R兩種亞型，AT1R、AT2R均屬于G蛋白偶聯受體，AT1R與Gq蛋白相偶聯，促進細胞增殖、誘導血管內皮生長、促進炎癥介質的產生。AngⅡ與AT2R結合具有抑制細胞生長及血管內皮產生、抑制炎癥介質的產生，拮抗AT1R的作用[4-5]。

研究表明，ATR參與多種癌癥的發生發展，激活AT1R刺激肺癌細胞增殖，抑制癌細胞凋亡。激活AT2R對肺癌、前列腺癌、胰腺癌等具有抑制癌細胞增殖、促進癌細胞凋亡的作用[6-7]。ATR在正常宮頸組織表達，然而ATR對宮頸癌發生發展的影響尚未見系統研究。本研究結果表明，在由正常宮頸組織向CIN及宮頸癌發展過程中，AT1R和AT2R的mRNA及蛋白表達均逐漸增強。表明ATR可能與宮頸癌的發生發展過程有關。有研究報道在子宮內膜癌及卵巢癌組織中ATR的表達升高[8-9]，與本研究結果一致。表明在宮頸癌的發生發展中，與其他腫瘤一樣，ATR與癌細胞的增生增殖、腫瘤血管的形成密切相關。

AT1R與AT2R的信號轉導途徑不同，目前研究表明AT1R常見有兩條信號轉導途徑，第一條確定的信號轉導途徑為Gq蛋白激活蛋白磷脂酶進而生成第二信使肌醇磷脂，進一步水解為肌醇三磷酸、二脂酰甘油；第二條信號轉導途徑為AT1R通過激活酪氨酸激酶，使酪氨酸磷酸化，進而調節細胞外信號調節酶的激活[10]。AT2R的信號轉導途徑目前仍在研究中，迄今為止尚未定論，其途徑主要有AT2R激活PLA2，進而激活花生四烯酸的途徑、NO/cGMP參與的途徑以及激活蛋白磷酸酶等途徑[11]。本研究對AT1R信號轉導途徑中關鍵酶PTK及AT2R信號轉導途徑中關鍵酶PLA2進行研究發現，激活AT1R后，CIN組與宮頸癌組的PTK活性與對照組相比均明顯升高，與CIN組相比宮頸癌組進一步升高。激活AT2R后，CIN組與宮頸癌組的cPLA2活性與對照組相比均明顯升高，與CIN組相比宮頸癌組進一步升高。說明在宮頸癌發生發展的過程中，AT1R、AT2R的表達水平增加的同時，其活性也隨之增加。有研究表明，激活AT1R后刺激癌細胞增殖，抑制癌細胞凋亡；激活AT2R后抑制癌細胞增殖，誘導癌細胞凋亡。癌細胞的增殖與凋亡是一個動態的過程，只有癌細胞的增殖大于凋亡，腫瘤才表現出高度增長活性[12-15]。如果能利用AT1R、AT2R在宮頸癌中的表達及活性特點，抑制AT1R活性，激活AT2R活性，不失為一種治療宮頸癌的新方向。

綜上所述，在宮頸癌的發生發展中，AT1R、AT2R的表達逐漸增高，活性逐漸增強，抑制AT1R活性，激活AT2R活性，可能為治療宮頸癌的一種新思路。

[參考文獻]

[1] Livak KJ，Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta DeltaC（T）） method [J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[2] Banerjee R，Kamrava M. Brachytherapy in the treatment of cervical cancer： a review [J]. Int J Womens Health，2014， 6：555-564.

[3] Loureiro J，Oliva E. The spectrum of cervical glandular neoplasia and issues in differential diagnosis [J]. Arch Pathol Lab Med，2014，138（4）：453-483.

[4] Tsukamoto I，Inoue S，Teramura T，et al. Activating types 1 and 2 angiotensin Ⅱ receptors modulate the hypertrophic differentiation of chondrocytes [J]. FEBS Open Bio，2013，（3）：279-284.

[5] 師樹田，李艷芳.衰老大鼠心臟血管緊張素Ⅱ受體對α1腎上腺素受體信號轉導的影響[J].中華老年心腦血管病雜志，2013，15（1）：71-73.

[6] Kawabata A，Baoum A，Ohta N，et al. Intratracheal administration of a nanoparticle-based therapy with the angiotensin Ⅱ type 2 receptor gene attenuates lung cancer growth [J]. Cancer Res，2012， 72（8）：2057-2067.

[7] Doi C，Egashira N，Kawabata A，et al. Angiotensin Ⅱ type 2 receptor signaling significantly attenuates growth of murine pancreatic carcinoma grafts in syngeneic mice [J]. BMC Cancer，2010，10：67.

[8] Piastowska-Ciesielska AW，Piuciennik E，Wójcik-Krowiranda K，et al. Correlation between VEGFR-2 receptor kinase domain-containing receptor（KDR）mRNA and angiotensin Ⅱ receptor type 1（AT1-R）mRNA in endometrial cancer [J]. Cytokine，2013，61（2）：639-644.

[9] Bi FF，Li D，Cao C，et al. Regulation of angiotensin Ⅱ type 1 receptor expression in ovarian cancer： a potential role for BRCA1 [J]. J Ovarian Res，2013，6（1）：89.

[10] Akazawa H，Yano M，Yabumoto C，et al. Angiotensin Ⅱ type 1 and type 2 receptor-induced cell signaling [J]. Curr Pharm Des，2013，19（17）：2988-2995.

[11] Horiuchi M，Iwanami J，Mogi M. Regulation of angiot-ensin Ⅱ receptors beyond the classical pathway [J]. ClinSci（Lond），2012，123（4）：193-203.

[12] 陶雅軍，毛俊，張晴晴，等.Hedgehog信號通路在乳腺癌CD44+CD24-中激活[J].山東醫藥，2011，51（16）：33-35.

[13] 周旸.宮頸癌患者血清IL-17、血清VEGF水平的檢測的臨床價值探究[J].中國性科學，2013，22（6）：9-11.

[14] 孫濤，袁志偉，樊紅麗，等.宮頸癌116例臨床病理分析[J].臨床誤診誤治，2009，22（z1）：70-71.

[15] 徐鐵兵，邢春英，王維琴，等.35245例宮頸癌篩查結果分析[J].中國性科學，2012，21（4）：11-14，18.

（收稿日期：2014-07-08 本文編輯：任 念）

[4] Tsukamoto I，Inoue S，Teramura T，et al. Activating types 1 and 2 angiotensin Ⅱ receptors modulate the hypertrophic differentiation of chondrocytes [J]. FEBS Open Bio，2013，（3）：279-284.

[5] 師樹田，李艷芳.衰老大鼠心臟血管緊張素Ⅱ受體對α1腎上腺素受體信號轉導的影響[J].中華老年心腦血管病雜志，2013，15（1）：71-73.

[6] Kawabata A，Baoum A，Ohta N，et al. Intratracheal administration of a nanoparticle-based therapy with the angiotensin Ⅱ type 2 receptor gene attenuates lung cancer growth [J]. Cancer Res，2012， 72（8）：2057-2067.

[7] Doi C，Egashira N，Kawabata A，et al. Angiotensin Ⅱ type 2 receptor signaling significantly attenuates growth of murine pancreatic carcinoma grafts in syngeneic mice [J]. BMC Cancer，2010，10：67.

[8] Piastowska-Ciesielska AW，Piuciennik E，Wójcik-Krowiranda K，et al. Correlation between VEGFR-2 receptor kinase domain-containing receptor（KDR）mRNA and angiotensin Ⅱ receptor type 1（AT1-R）mRNA in endometrial cancer [J]. Cytokine，2013，61（2）：639-644.

[9] Bi FF，Li D，Cao C，et al. Regulation of angiotensin Ⅱ type 1 receptor expression in ovarian cancer： a potential role for BRCA1 [J]. J Ovarian Res，2013，6（1）：89.

[10] Akazawa H，Yano M，Yabumoto C，et al. Angiotensin Ⅱ type 1 and type 2 receptor-induced cell signaling [J]. Curr Pharm Des，2013，19（17）：2988-2995.

[11] Horiuchi M，Iwanami J，Mogi M. Regulation of angiot-ensin Ⅱ receptors beyond the classical pathway [J]. ClinSci（Lond），2012，123（4）：193-203.

[12] 陶雅軍，毛俊，張晴晴，等.Hedgehog信號通路在乳腺癌CD44+CD24-中激活[J].山東醫藥，2011，51（16）：33-35.

[13] 周旸.宮頸癌患者血清IL-17、血清VEGF水平的檢測的臨床價值探究[J].中國性科學，2013，22（6）：9-11.

[14] 孫濤，袁志偉，樊紅麗，等.宮頸癌116例臨床病理分析[J].臨床誤診誤治，2009，22（z1）：70-71.

[15] 徐鐵兵，邢春英，王維琴，等.35245例宮頸癌篩查結果分析[J].中國性科學，2012，21（4）：11-14，18.

（收稿日期：2014-07-08 本文編輯：任 念）

[4] Tsukamoto I，Inoue S，Teramura T，et al. Activating types 1 and 2 angiotensin Ⅱ receptors modulate the hypertrophic differentiation of chondrocytes [J]. FEBS Open Bio，2013，（3）：279-284.

[5] 師樹田，李艷芳.衰老大鼠心臟血管緊張素Ⅱ受體對α1腎上腺素受體信號轉導的影響[J].中華老年心腦血管病雜志，2013，15（1）：71-73.

[6] Kawabata A，Baoum A，Ohta N，et al. Intratracheal administration of a nanoparticle-based therapy with the angiotensin Ⅱ type 2 receptor gene attenuates lung cancer growth [J]. Cancer Res，2012， 72（8）：2057-2067.

[7] Doi C，Egashira N，Kawabata A，et al. Angiotensin Ⅱ type 2 receptor signaling significantly attenuates growth of murine pancreatic carcinoma grafts in syngeneic mice [J]. BMC Cancer，2010，10：67.

[8] Piastowska-Ciesielska AW，Piuciennik E，Wójcik-Krowiranda K，et al. Correlation between VEGFR-2 receptor kinase domain-containing receptor（KDR）mRNA and angiotensin Ⅱ receptor type 1（AT1-R）mRNA in endometrial cancer [J]. Cytokine，2013，61（2）：639-644.

[9] Bi FF，Li D，Cao C，et al. Regulation of angiotensin Ⅱ type 1 receptor expression in ovarian cancer： a potential role for BRCA1 [J]. J Ovarian Res，2013，6（1）：89.

[10] Akazawa H，Yano M，Yabumoto C，et al. Angiotensin Ⅱ type 1 and type 2 receptor-induced cell signaling [J]. Curr Pharm Des，2013，19（17）：2988-2995.

[11] Horiuchi M，Iwanami J，Mogi M. Regulation of angiot-ensin Ⅱ receptors beyond the classical pathway [J]. ClinSci（Lond），2012，123（4）：193-203.

[12] 陶雅軍，毛俊，張晴晴，等.Hedgehog信號通路在乳腺癌CD44+CD24-中激活[J].山東醫藥，2011，51（16）：33-35.

[13] 周旸.宮頸癌患者血清IL-17、血清VEGF水平的檢測的臨床價值探究[J].中國性科學，2013，22（6）：9-11.

[14] 孫濤，袁志偉，樊紅麗，等.宮頸癌116例臨床病理分析[J].臨床誤診誤治，2009，22（z1）：70-71.

[15] 徐鐵兵，邢春英，王維琴，等.35245例宮頸癌篩查結果分析[J].中國性科學，2012，21（4）：11-14，18.

（收稿日期：2014-07-08 本文編輯：任 念）