乙醇對實驗小鼠精子DNA完整性與精子動態參數的相關影響

（瀘州醫學院附屬醫院泌尿外科，四川 瀘州 646000；醫學院附屬醫院護理部）

當前世界范圍內約15%的夫婦患有不孕不育，這與遺傳、生態環境、內分泌等多種因素密切相關，而由男性精子質量下降引起者約占不孕不育人群的一半左右[1]，研究酒精對人類的生殖毒性具有重要意義。常規的精液分析能夠從精子常規參數方面反映精液質量，但是其在精子功能的評價方面價值有限，不能直接反映精子受精能力和對胚胎發育的影響，而精子DNA 的完整性對男性不育是一個有價值的評估指標[2]，而精子DNA 的損傷是否與精子運動能力相互關聯尚不清楚。本研究通過建立不同劑量的飲酒實驗小鼠模型，觀察酒精對實驗小鼠精子DNA 的完整性及精子動態參數的影響，為拓寬男性不育的診斷及治療措施提供實驗依據。現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用SPF 級昆明種雄性小白鼠60 只，體質量25～30 g，6～8 周齡，由湖北醫藥學院動物中心提供。適應性喂養一周后用于試驗，飼養過程中，實驗小鼠均自由采食、飲水，每天早中晚3 次喂食換水，保證充足的水、食物供應，籠中保持清潔。環境溫度20～25℃，日照時間12 h。將實驗小鼠隨機分為4 組，每組15 只，對照組給予5 g/kg.d 蒸餾水灌胃，低、中、高劑量酒精組分別給予無水酒精（0.5 g/(kg·d）、2.5 g/(kg ·d）、5 g/(kg ·d）灌胃，連續20 周。

1.2 檢測儀器 流式細胞儀、生化分析儀、722 型光柵分光光度計、MK-3 型酶標儀、計算機輔助精子分析儀、熒光顯微鏡等。

1.3 染色體結構分析(spermchromosomestructure analysis，SCSA)測定精子DNA 完整性 末次灌胃24 h 后采用頸椎脫臼法將實驗小鼠處死，取各組實驗小鼠右側附睪組織制備精子懸液，40μL 精子懸液中加入160μL TNE buffer(0.01 mol/L Tris-cl，0.15 mol/L Nacl，1mmol/L disodium EDTA，pH=7.4)，稀釋精子懸液至體積為200μL，密度1～2 ×106/mL，立刻加入400μL 酸處理液（0.08 mol/L HCL，0.15 mol/L NaCl，0.1%W/V Triton，pH=1.2）振蕩混勻，30 s 后加入1.2 mL AO 染液（6μg/ml AO 溶于0.037 mol/L Citricacid，0.12 mol/LNa2HPO4，1.1 mmol/LDisodium EDTA，0.15 mol/L NaCl，pH=6.0）30 min，標本用熒光顯微鏡(520 nm 激發光)觀察精子，用流式細胞液測定精子DNA 片段化指數（DFI）。計數每只動物200 個精子中綠色、紅色和橙黃色精子數，其中綠色為DNA 雙鏈精子、紅色為DNA 單鏈、橙黃色為DNA 雙鏈不穩定精子。計算出紅色、橙黃色熒光精子的百分率，即為精子DNA 碎片化指數(DNA fragmentation index，DFI)，精子DNA 完整性=1-DFI。

1.4 精子動態參數的測定 末次灌胃24 h 后采用頸椎脫臼法將實驗小鼠處死，取各組實驗小鼠右側附睪尾部精子，將其懸浮于精子營養液中(HBSS 中加入4.2g/L 的Hepes，0.35 g/L 的NaHCO3，2.0 g/L 的BSA，0.9 g/L 的D-glucose，0.1 g/L 的sodium pyruvate 和0.025 g/L 的soybean trypsin inhibito，pH=7.4，37℃)，使用計算機輔助精子分析儀進行分析，具體參數包括精子密度(sperm concentration)、平均速率(average path velocity，VAP)、直線運動速率(velocity straight linear，VSL)、曲線運動速率(curvilinear velocity，VCL)、精子頭側擺幅度(amplitude of lateral head displacement，ALH)、鞭打頻率(beat cross frequency，BCF)、前向性(straightness，STR)、直線性(1inearity，LIN)。

1.5 統計學處理 采用SPSS17.0 軟件進行統計分析，檢測數據以±s 表示，采用方差分析和t 檢驗。

2 結果

對照組與各酒精組精子DNA 完整性與精子參數的比較詳見表1。與對照組相比較，各劑量酒精組的精子DNA 完整性明顯高于對照組，精子動態參數均明顯減弱，具有顯著性差異（P<0.01 或P<0.05）。

表1 各組精子DNA 完整性及精子動態參數比較(n=15，±s)

表1 各組精子DNA 完整性及精子動態參數比較(n=15，±s)

注：與對照組比較：*P<0.01，ΔP<0.05.

組 別 精子密度 DFI 直線運動速率 曲線運動速率 精子頭側擺幅度 鞭打頻率 前向性 直線性(×106/mL) (%) (m/s) (m/s) (m) (HZ) (%) (%)對 照 組 12.86 ±6.201 1 6.11 ±4.49 4.66 ±2.861 16.1 ±2.818 3.50 ±0.706 5.04 ±0.546 62.0 ±18.285 54.6 ±4.750低劑量組 8.02 ±5.161 27.01 ±5.18* 3.9 ±2.818Δ 13.4 ±3.525 2.54 ±0.773Δ 3.56 ±0.702Δ 54.5 ±17.578Δ 48.1 ±4.143Δ中劑量組 7.63 ±4.583 31.27 ±5.65* 2.4 ±2.667Δ 10.9 ±4.232 1.92 ±0.767Δ 2.43 ±0.642Δ 32.5 ±16.163Δ 26.45 ±7.536Δ高劑量組 7.77 ±4.463 37.43 ±7.18* 2.03 ±2.55Δ 7.48 ±6.353 0.94 ±0.626Δ 1.45 ±0.616* 16.3 ±15.456Δ 18.51 ±7.628Δ

3 討論

不育癥是全球性的醫學和社會性問題，在不育的夫婦當中，男性生殖能力異常者約占60%。世界衛生組織將夫妻雙方均不采用任何避孕措施生活1年以上，且由于男方因素造成女方不孕者，稱之為男性不育癥[3]。隨著生物化學技術手段的不斷發展，精液分析目前已成為臨床常用的評價男性生育功能的重要檢測指標，而精子DNA 完整性的評價及男性附屬性腺功能對男性生殖能力的影響越來越受到人們的重視[4]。

精液主要由精子和精漿組成，而精漿則是由附屬性腺的分泌物組成[5]（其中約60%來自精囊，30%來自前列腺，其余10%來自于附睪和尿道球腺等）。精漿是精子的運載物，可以起到中和、緩沖和保護精子的作用，使精子可以在陰道酸性環境中存活；并為精子提供能量和營養物質。精漿里含有果糖和蛋白質，是精子的營養物質。另外，精漿中還含有前列腺素和一些酶類物質。精漿的化學成分主要有[6]：1)水：約占90%以上。2)糖類：主要是果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等。3)脂類：包括膽固醇、睪酮、前列腺素(脂肪酸衍生物)等。4)蛋白質：包括非酶蛋白質，如去能因子、蛋白酶抑制劑、乳鐵傳遞蛋白、抗糜蛋白酶，抗胰蛋白酶、免疫球蛋白等；酶蛋白，包括酸性磷酸酶、透明質酸酶、糖苷酶、精素、纖溶酶原激活劑等。5)肽類激素：如FSH、LH、催乳素等。6)胺類：如精胺、亞精胺、精胺素等。7)氨基酸：如精氨酸、谷氨酸等20 多鐘。8)有機酸及有機堿：如檸檬酸、肉毒堿、甘油磷酸膽堿、乳酸等。9)無機離子：如鋅、鎂、鈣、銅、鉀、氯、鈉等。此外，精漿中還含有山梨醇、肌醇等。任何附屬性腺的病變都會導致精漿生化指標的異常。因此，檢測精漿生化指標的變化有助于了解附屬性腺的分泌功能、代謝狀態和病理改變等，從而為男性不育的診斷及治療上提供依據[7]。

精子染色質結構分析法(SCSA)由Evenson 等提出[8]：用熱或酸處理已液化的精子，由于受損傷和未成熟精子的魚精蛋白巰基未發生氧化，染色質結構松散，DNA 在酸的作用下易變性成單鏈。吖啶橙是一種熒光絡黃染料，具有高度的異染性，以插入的方式與雙螺旋的DNA 分子結合，應用吖啶橙染液的異染性可對損傷和正常的精子DNA 進行區分，以評估精子DNA 的完整性。染色后斷裂的精子單鏈DNA在熒光顯微鏡下呈紅色熒光，而正常精子雙鏈DNA呈綠色熒光，其結果通過流式細胞儀檢測。此外，SCSA 分析所獲另一項指標-高DNA 可染性(HDS)代表了呈強綠色熒光的精子百分率，可作為反映精子成熟度的指標。SCSA 參數反映了不同精子染色質構象的異質性，操作快速簡便，結果直觀可靠，可定量檢測，便于標準化，是臨床最常用的DNA 完整性檢測方法[9]。細胞核DNA 是精子的主要遺傳物質，其完整性是遺傳物質正確傳遞給子代的前提，對于子代的繁衍具有重要意義，在受精和胚胎發育中發揮重要作用。在人類精子發生過程中，染色質的DNA結合蛋白主要為魚精蛋白，其在分子內外能夠形成二硫鍵交聯，具有保護精子DNA 完整性，使DNA 免受損傷的作用。但是，在正常和不育男性精液中，均存在一定程度的精子DNA 損傷。有研究報道精子DNA 損傷會對自然生育和輔助生殖技術治療結局產生負面影響，并與復發性流產相關。自然受孕過程中，DNA 受損的精子幾乎不可能與卵子成功結合并完成受精。研究表明，DNA 損傷程度與自然受孕率呈顯著負相關，如果男性精子DNA 損傷率>30%，則自然生育的可能性幾乎為零[10]。精子DNA 損傷的機制尚不明確，可能是多種因素共同作用的結果。例如：精子發生過程中染色質組裝異常，精子在發生及生殖道轉運過程中遭受毒物和氧化應激的損傷，以及精子細胞異常凋亡等。精子DNA 損傷分析是比傳統精液常規分析參數更穩定、更敏感地預測男性生育能力的指標。精子DNA 完整度分析區別不育和生育能力正常的特異度為89.4%，敏感度為96.9%，這提示精子染色質或DNA 完整性可能是精子質量的獨立預測指標，作為精子質量臨床評價標準具有優越的可行性[11]。

精子動態參數是精子許多功能的一種綜合而直觀的表現，是正常生理狀態下完成受精過程的基礎，是評價成熟精子功能的重要指標之一，對評價生育能力十分重要[12]。本研究顯示各酒精組實驗小鼠在直線運動速率、精子頭側擺幅度、鞭打頻率、前向性、直線性方面較對照組均有明顯減弱，說明酒精對精子的活動能力方面有著明顯的影響。

酒精是親脂性的小分子物質，其代謝產物乙醛能與各種蛋白質結合，形成乙醛-蛋白質毒物[13]，此毒物可抑制蛋白質的合成，干擾細胞膜中類脂和蛋白結構，導致細胞功能障礙。結果表明，1)與對照組相比較，各劑量酒精組的精子DNA 完整性明顯高于對照組，差異具有顯著性差異（P<0.01）。2)各酒精組實驗小鼠在直線運動速率、精子頭側擺幅度、鞭打頻率、前向性、直線性方面較對照組均有明顯減弱，差異具有統計學意義（P<0.05 或P<0.01）。說明酒精一方面直接作用于睪丸，使生精細胞退化變性，精子產生受到抑制，精子質量和活動能力下降，另一方面直接或間接地作用于附屬性腺，使精子失去精漿對其的能量供應、穩定染色質及減少氧自由基傷害等作用[14]，從而進一步影響睪丸的生殖能力，導致不育的發生。

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