龜羚帕安丸對帕金森病大鼠模型多巴胺能神經元凋亡影響的研究*

孟 毅，喬明亮，寧亞紅，常學輝

(1．河南中醫學院第二附屬醫院，河南 鄭州450002; 2．河南中醫學院2012 級碩士研究生，河南鄭州450046)

帕金森病(Parkinson's dieses，PD)是以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢異常為主要表現的神經系統變性疾病。隨著現代社會人口老齡化，PD 發病率有逐年增高的趨勢，治療上多以左旋多巴替代性療法和對癥治療為主，但長期服用會致不良反應日趨嚴重。中醫學對帕金森病的認識有悠久的歷史，對帕金森病的治療經驗亦頗豐。龜羚帕安丸是趙國華教授的經驗用方，對帕金森病的治療有顯著療效［1］。本研究擬通過實驗的方法探討龜羚帕安丸治療帕金森病的作用機制，為其治療帕金森病提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 動 物

SD 大鼠，SPF 級，雄性，體質量(200 ±20)g，由河南省實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(豫)2010－0002。飼養條件:在河南省中醫院中心實驗室〔使用許可證為SYXK(豫)2011－0002)〕飼養，SPF 級飼料，IVC 大鼠獨立通風飼育盒，溫度18～26 ℃，濕度40%～70%。

1．2 藥品、試劑與儀器

龜羚帕安丸，由龜板、羚羊角、全蝎、威靈仙、厚樸等組成，為河南省中醫院院內制劑，批號20130511。美多芭(多巴絲肼片)，上海羅氏制藥有限公司產品，批號SH1652。6－羥基多巴胺(批號SLBF550V)、阿撲嗎啡(批號SLBF6369V)，均購自美國Sigma 公司。細胞凋亡試劑盒(批號09F20C)、兔抗 Bax (批 號 08G19B)、兔 抗 Bcl-2 (批 號08H12D)、DAB 顯色試劑盒(批號130304)、PBS 緩沖液(批號130617)，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。大鼠腦立體定向儀，美國Stoelting 公司產品;牙科鉆、5 μL 微量進樣器，均為上海安亭微量進樣器廠產品;Olympus 光學顯微鏡，產地日本。

1．3 模型的建立

參照周厚廣等［2］帕金森病大鼠模型的建立。將SD 大鼠適應性喂養1 周，進行反復行為檢測，選擇無旋轉行為的作為實驗對象。隨機分為假手術組、實驗組和正常對照組。實驗組采用以下方法造模:①腦立體定向儀定位。稱大鼠體質量;以35 g/L水合氯醛8 μL/g 腹腔注射麻醉;以嚴格顱平位(前囟與后囟水平高度相差0．1 mm 以下)將大鼠固定于大鼠腦立體定向儀上;常規消毒，備皮;沿正中線切開頭皮，剝去骨膜，露出前后囟，參照文獻［3］確定左側黑質致密部(SNC)﹝(前囟后(5．0 ±0．2)mm，矢狀縫左側(1．7 ±0．1)mm，顱骨表面下(7．6 ±0．1)mm﹞，用牙科鉆小心鉆透顱骨。②微量進樣器注射。按確定坐標將微量進樣器按1 mm/min的速度緩慢進針到預定深度;注入6-OHDA(溶于含質量分數0．2 g/L 抗壞血酸的生理鹽水4 μL 中)8 μg，注射速度為1μL/ min;留針30 min;緩慢(1 mm/min)退針。術后用牙科膠覆蓋鉆孔，常規縫合傷口，連續3 d 腹腔注射青霉素10 萬U/kg 預防感染。

假手術組只注射含0．2 g/L 抗壞血酸的等量生理鹽水，其余條件與造模手術相同。術后10 d 開始行為檢測，以阿樸嗎啡(Apomorphine，APO)按0．5 μg/g 體質量腹腔注射，觀察其行為變化。若大鼠恒定轉向右側，且旋轉圈數＞7 r/ min，則視為成功PD 大鼠模型;若大鼠不出現旋轉、旋轉方向不恒定、恒定轉向左側或恒定轉向右側但速度較慢(＜7 r/min)，則視為不成功PD 模型。

1．4 動物分組與給藥

將造模成功的PD 大鼠隨機分為模型對照組、美多巴組和龜羚帕安丸大、中、小劑量組5 組。分別每日管飼同等容積的生理鹽水、美多芭10 μg/(g·d)、龜羚帕安丸4．0 ，2．0，1．0 g/(kg·d)。另設假手術組，常規飼養，每日管飼同等容積的生理鹽水。1 d 1 次，共30 d。

1．5 檢測指標

1．5．1 取 材

實驗結束后，取每組動物進行心臟灌注固定:以35 g/L 水合氯醛8 μL/g 給予深度麻醉后打開胸腔，暴露心臟;經左心室行主動脈灌注固定，先用生理鹽水200 mL 進行預灌注，灌注速度由快轉慢，直到從右心耳流出的液體變清亮，再用40 g/L 多聚甲醛200 mL 灌注，當見到大鼠雙后肢抽搐，尾部變黃，表示灌注完成。完整剝取腦組織，分離出中腦黑質，在同一固定液中4 ℃固定4～6 h。

1．5．2 黑質TUNEL 陽性細胞數

采用TUNEL 法觀察。常規石蠟包埋，切片，片厚為5 μm，按試劑盒方法操作。

1．5．3 Bax、Bcl-2 陽性細胞數

采用免疫組化法檢測。采用抗生物素－ 生物素－ 過氧化物酶復合物(ABC)法，按試劑盒方法操作。在光鏡高倍鏡下隨機取4 mm2視野，計算染色陽性細胞數。分析軟件使用IMS 彩色圖像分析系統軟件。

1．6 統計學方法

采用SPSS 13．0 統計分析軟件處理。數據以均數()±標準差(s)表示，多樣本組間比較采用方差分析。以P＜0．05 為差別有統計學意義。

2 結 果

與假手術組對比，模型對照組大鼠黑質細胞凋亡陽性細胞數及Bcl-2、Bax 陽性細胞數升高，Bcl-2/Bax的比值下低，差別有統計學意義(P＜0．01)。與模型對照組對比，龜羚帕安丸大、中、小劑量組及美多芭組大鼠黑質細胞凋亡陽性細胞數及Bax 陽性細胞數降低，Bcl-2 陽性細胞數及Bcl-2/Bax 的比值升高，差別有統計學意義(P＜0．01)。與美多芭組對比，龜羚帕安丸大劑量組Bax 陽性細胞數降低，Bcl-2/Bax 的比值升高，差別有統計學意義(P＜0．05 或P＜0．01);大鼠黑質細胞凋亡陽性細胞數、Bcl-2 陽性細胞數對比，差別無統計學意義(P＞0．05)。與龜羚帕安丸中、小劑量組對比，大劑量組大鼠黑質細胞凋亡陽性細胞數及Bax 陽性細胞數降低，Bcl-2陽性細胞數及Bcl-2/Bax 的比值升高，差別有統計學意義(P＜0．05 或P＜0．01)。見表1。

表1 各組大鼠黑質TUNEL 陽性細胞數、Bcl-2、Bax 陽性細胞數及Bcl-2/Bax 對比 個，±s

表1 各組大鼠黑質TUNEL 陽性細胞數、Bcl-2、Bax 陽性細胞數及Bcl-2/Bax 對比 個，±s

注:與假手術組對比，＊＊＊P ＜0．01;與模型對照組對比，### P ＜0．01;與美多芭組對比，△P ＞0．05，△△△P ＜0．01;與龜羚帕安丸中劑量組對比，＊＊＊P ＜0．01，＊＊ P ＜0．05;與龜羚帕安丸小劑量組對比，▲▲▲P ＜0．01。

組 別 動物數 凋亡細胞數/個 Bcl-2/個 Bax/個Bcl-2/Bax假手術組 8 3．1±0．43 4．23±0．63 4．43±1．77 1．08±0．39模型對照組 8 38．01±3．24＊＊＊ 14．34±2．43＊＊＊ 38．64±4．40＊＊＊ 0．36±0．02＊＊＊美多芭組 8 8．60±0．94### 40．18±2．20### 14．92±2．07### 2．72±0．24###龜羚帕安丸大劑量組 8 7．56±0．86###△＊＊＊▲▲▲ 41．20±5．13###△＊＊▲▲▲ 10．87±2．81###△△△＊＊＊▲▲▲ 3．91±0．59###△△△＊＊＊＊＊▲▲▲龜羚帕安丸中劑量組 8 10．61±1．57### 34．87±5．42### 18．56±2．40### 1．87±0．08###龜羚帕安丸小劑量組 8 18．08±2．36### 26．05±4．22### 30．37±2．83### 0．85±0．07###

3 討 論

帕金森病屬于中醫學“顫證”“震顫”的范疇。歷代醫家認為:該病病機多屬本虛標實，本虛是肝腎陰虛，標實為“瘀”“痰”“風”互結、蘊塞腦竅。趙國華教授認為:該病的病理過程初期由實到虛;中期由虛致瘀，表現為虛實夾雜證候;后期為諸臟精血虛損，虛損互為因果，連鎖反應過程。他提出了初期宜予以平肝熄風以治標，健脾益氣以治本;中期宜豁痰化瘀以治標，滋補肝腎以治本;后期宜補益精血以治損的治療三法［4］。龜羚帕安丸是治療帕金森病的經驗用方，方中龜板味甘性平，滋陰潛陽，補腎活血;羚羊角味咸性寒，平肝熄風;全蝎味咸性平，祛風止痙通絡;威靈仙味辛咸性溫，搜風通絡;厚樸味苦辛性溫，燥濕化痰。諸藥合用，共奏滋補肝腎、化痰活血之效。細胞凋亡是在體內外因素的誘導下，由嚴格和復雜的信號網絡調控而發生的自主性細胞有序死亡過程，是機體維持細胞數量穩定的重要手段。細胞凋亡調控異?？赡艹蔀槟承┘膊〉闹匾l病機制。［5］細胞凋亡的機制主要有興奮性氨基酸中毒、自由基損傷、鈣超載、調節基因(Bcl-2、Bax、P53、Fas、TNF-α)等表達失調。Mochizuki 等［6］通過TUNEL檢測發現黑質多巴胺能神經元發生細胞凋亡，一些研究表明細胞凋亡參與了帕金森病的發病過程，曹非等［7］的實驗研究也證實了這一點。本實驗采用TUNEL 方法證實PD 大鼠模型黑質損傷側呈現典型的黑質凋亡細胞的存在，證實細胞凋亡參與了大鼠帕金森病的發病。黃月等［8］研究表明:6-OHDA 誘導黑質細胞凋亡可能是通過誘導細胞氧化應激反應來調節Bcl-2 家族特別是Bcl-2 和Bax 的表達而導致的。Bc1-2 蛋白家族是哺乳動物細胞凋亡的重要調控因子，包括抗凋亡成分Bcl-2 和Bc1-x1 以及促凋亡成分Bax 等重要蛋白。李立宏等［9］通過實驗研究表明:Bcl-2 及Bax 的表達量及Bcl-2/Bax 的變化可以調節細胞死亡和存活間的平衡，決定著凋亡的發生。本實驗結果顯示:模型對照組與假手術組對比，Bcl-2 及Bax 升高，Bcl-2/Bax 比值降低，但以Bax 升高為主，說明Bcl-2 及Bax 都參與了細胞的凋亡，但以Bax 為主導;龜羚帕安丸大、中、小劑量組和美多芭組與模型對照組對比，Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值都升高，Bax 降低，說明龜羚帕安丸可能主要是提高Bcl-2 的表達及Bcl-2/Bax 比值、抑制Bax 表達，從而具有保護神經細胞的作用。

［1］常學輝，張良芝，李彥杰．龜羚帕安丸配合美多巴片治療帕金森病30 例療效觀察［J］．新中醫，2008，40(6):62－63．

［2］周厚廣，陸建明，鮑遠程，等．6－羥基多巴胺帕金森病大鼠模型的建立與評價［J］．中國行為醫學科學，2002，11(1):4－7．

［3］包新民，舒斯云．大鼠腦立體定位圖譜［M］．北京:人民衛生出版社，1991:49－58．

［4］李彥杰，李社宣．趙國華治療帕金森病經驗［J］．光明中醫，2004，19(4):42－43．

［5］李桂源．病理生理學［M］．北京:人民衛生出版社，2010:31－42．

［6］Mochizuki H，Goto K，Mori H，et al．Histochemical detection of apoptosis in Parkinson＇s disease［J］．J Neurol Sci，1996，137(2):120－123．

［7］曹非，駱芳，段國安．大鼠帕金森病發病過程中黑質細胞凋亡及其相關基因表達［J］．中國老年學雜志，2007，27(24):2369－2371．

［8］黃月，張善鋒，許予明，等．6－羥基多巴胺誘導帕金森病大鼠相關蛋白及mRNA 的表達［J］．鄭州大學學報:醫學版，2011，46(2):222－225．

［9］李立宏，高國棟，安煒琪，等．帕金森病神經元死亡機制:Bcl-2 與多巴胺誘導PC12 細胞凋亡的相關性研究［J］．現代康復，2001，5(12):44－45．