HBV BCP區1762/1764和1896突變位點檢測新技術研究

王 澤，唐景峰

(1.陽泉市第三人民醫院，山西 陽泉 045000;2.武漢大學生命科學學院/病毒學國家重點實驗室，湖北武漢 430072)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)嚴重危害人類健康，是引起肝臟疾病的主要致病病毒之一［1，2］。全球約有20億人感染過HBV，其中慢性HBV攜帶者有4億人之多，每年造成的死亡人數約有100萬。乙型肝炎病毒的發病機制主要是機體清除HBV而引發的細胞免疫病理改變，較早的研究顯示在HBV感染過程中HBeAg的轉陰預示病毒的清除和疾病的好轉［3］。但近期研究發現乙肝病毒感染機體后，相當部分HBeAg轉陰是為逃避免疫清除而發生的變異［4～6］。

HBV DNA C區啟動子(The basal core promoter，BCP)負責調控編碼HBeAg和核心抗原的RNA的轉錄，BCP序列中的雙突變1762(A→T)和1764(G→A)經常相伴出現，研究資料表明BCP雙突變與爆發性肝炎和慢性化有關［7］。前C區1896位點也是最常見的變異位點之一，該位點G-A的替換，使編碼色氨酸的密碼子UGG變為終止密碼子。1762/1764和1896的突變均可引起HBeAg不表達，逃避機體的免疫清除，故臨床檢測該基因變異對肝炎的治療有重要意義。本實驗采用錯配擴增和熒光PCR結合的突變分析法(MAMA-PCR)檢測基因突變［8～10］，每個位點含兩對特異性引物(A和B)和1條特異性含熒光標記的Taqman探針，引物A對野生型和突變型序列都能正常擴增，而引物B為錯配引物，對突變型序列能正常擴增，對野生型序列則不能擴增或擴增效率極低。對每個樣本均分別用引物A和引物B在不同的PCR管內擴增，根據引物A和B兩者擴增所得Ct值的差異即可判斷位點突變的發生與否。

圖1 錯配擴增熒光PCR原理Fig 1 The Principle of Mismatch Amplification and Fluorescent PCR

本研究主要針對突變位點檢測，對比金標準測序法和MAMA-PCR熒光法樣本檢測的差異，分析MAMA-PCR法檢測樣本的準確性，為臨床HBV BCP區和前C區突變位點的檢測提供新的檢測方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月～2013年6月就診于山西省陽泉市第三人民醫院的被確診為慢性乙型肝炎患者血清132例，男70例，女62例，平均年齡36歲，均符合2000年西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》中的慢性乙型肝炎的診斷標準。收集血清于－70℃保存。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 SLAN96P實時熒光PCR儀購自上海宏石醫療科技有限公司，ABI7500實時熒光PCR儀購自ABI公司，病毒核酸提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，BCP區1762/1764和前C區1896位點基因突變檢測試劑盒購自武漢百泰基因工程有限公司，dNTPs和Taq酶等生化試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2.2 操作 a)樣本處理:取患者的血清及試劑盒中的對照品各100 μL，嚴格按照核酸提取試劑盒說明書分離提取樣本核酸用于項目檢測。b)測序檢測:從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找 HBV 不同亞型核酸序列，經同源比對后選擇保守區域針設計PCR擴增引物(見表1)。

表1 各組反應引物和探針序列Table 1 Various Reaction of Primer and Probe Sequence

結果判斷標準:如果樣品PCR反應管A擴增曲線不呈S型或Ct(A)＞36，判定樣品HBV DNA含量小于檢測下限;若|Ct(A)-Ct(B)|≤7.00，則該樣本的檢測位點存在突變;若|Ct(A)-Ct(B)|＞7.00，則該樣本的檢測位點為野生型突變的含量超出檢測下限，即不存在突變。

PCR擴增程序為94℃，5 min;94℃，10 s;56℃，30 s;72℃，45 s;34 cyc;72℃，10 min。PCR 產物電泳切膠回收，送生物工程(上海)股份有限公司測序，分析基因位點是否為突變。c)熒光PCR擴增:通過軟件Primer Express 3.0設計特定位點引物和探針，經引物篩選及體系優化后獲得最優的組合(見表1)，用于HBV樣本檢測。每個位點的檢測分為A和B兩管進行，反應體系為 50 μL:5 μL 10 × buffer，0.2 mM dNTPs，0.4 mM dUTP，1 U UNG，0.4 μM 引物，探針0.2 μM，2 U Taq 酶。反應條件為:50℃，2 min;95℃，3 min;95℃，10 s;60℃，1 min，40 cyc(收集熒光信號)。

2 結果

2.1 MAMA-PCR突變方法性能評估

穩定性和精密度檢測:以該方法組裝的科研試劑中野生型和突變性陽性參考品作為模板，分別以A和B反應液檢測3次，每次反應設置10個重復，分析批間和批內差異，對方法的重復性進行考核。結果表明，BCP區1762/1764雙突變和前C區1896突變試劑A反應液檢測兩種參考品的Ct值基本一致，差異無統計學意義(P＞0.05);B反應液檢測突變參考品的Ct值約為16，野生型參考品Ct值約為25.5，批間和批內變異系數均＜5%，突變型和野生型的Ct值差異約為9.9，見表2和表3。

表2 BCP區1762/1764雙突變檢測試劑穩定性和精密度Table 2 The Stability and Precision of 1762/1764 of the BCP Double Mutations

表3 前C區1896突變檢測試劑穩定性和精密度Table 3 The Stability and Precision of Precore 1896 Site Mutation Test Reagents

2.2 特異性和靈敏度檢測

依據特異性參考品選取原則，選定甲型肝炎病毒I型2份、甲型肝炎病毒Ⅱ型3份、丙型肝炎病毒Ⅰ型2份、丙型肝炎病毒Ⅱ型1份、戊型肝炎病毒Ⅰ型1份、戊型肝炎病毒Ⅳ型1份，共10份特異性參考品，所有檢測結果均為陰性，MAMA-PCR試劑的特異性高，不存在交叉檢測問題;以1.0×104 IU/mL的最低檢測限突變型參考品檢測20次，結果顯示均為陽性，證明反應試劑的靈敏度可達到1.0×104 IU/mL(見圖2)。

圖2 靈敏度檢測:1.A反應液2.B反應液Fig 2 The Sensitivity Detection:1.A The Reaction Liquid 2.B Reaction Liquid

2.3 試劑檢測混合型HBV性能評估

將突變型和野生型質控品按照比例混合制備成突變型含量比例100%，90%，50%，20%，10%，1%和0的參考品，以1762/1764和1896兩個試劑的A反應液和B反應液進行檢測，結果表明BCP區1762/1764雙突變和前C區1896位點突變試劑檢測1%突變含量的混合參考品的Ct值差異均大于理論值6.6，可達到7，證明試劑可檢測出1%突變比例的HBV樣本(見圖3，圖4)。

圖3 1762/1764不同突變含量HBV檢測(Ct):1.A反應液2.B反應液Fig 3 1762/1764 Different mutations Content and HBV Detection(Ct):1.A Reaction Liquid 2.B Reaction Liquid

圖4 1896不同突變含量HBV(Ct)檢測:1.A反應液2.B反應液Fig 4 1896 Different Mutation HBV(Ct)Test:1.A Reaction Liquid 2.B Reaction Liquid

2.4 HBV樣本BCP區和前C區核酸測序分析

132份樣本核酸提取后經過PCR擴增后測序，與野生型HBV核酸序列比對分析(見圖5)。

圖5 樣本測序圖譜(1～3為1762/1764位點，4～6為1896 位點):1，4:野生型 2，5:突變型 3，6:混合感染型Fig 5 Sample Sequencing Atlas(1～3:1762/1764 Site，4～6:1896 Site):1，4:Wide Type 2，5:Mutant Type 3，6:Mixed Infection Type

分別統計1762/1764雙突變和1896突變情況:檢測出67例1762/1764雙突變數，突變比例為50.8%;檢測出39例1896突變，突變比例為29.5%，1762/1764和1896同時突變15例，突變比例11.4%，見表4。

2.5 HBV樣本突變試劑盒檢測分析

樣本提取后嚴格按照試劑盒說明書進行PCR檢測及結果判斷，經統計BCP區雙突變例數為69，突變比例52.3%，前C區1896位點突變例數為41，突變比例31.1%，1762/1764和1896同時突變18例，突變比例13.6%，見表4。

HBV樣本BCP區和前C區核酸MAMA－PCR法分析，HBV樣本檢測結果表明BCP區雙突變例數為69，突變比例52.3%，前 C區1896位點突變例數為42，突變比例31.8%，1762/1764和1896同時突變17例，突變比例12.9%，見表4。

表4 HBV測序法和PCR法對比統計Table 4 Comparison Statistic of HBV Sequencing and PCR Method

3 討論

HBeAg陽性在較早的研究中被認為是病毒在體內復制旺盛的一個重要指標，HBeAg由陽性轉為陰性是部分病毒被清除以及病情緩解的標志。研究發現HBeAg陽轉陰的感染者病情并非都趨于好轉，相當部分的慢性肝病患者都檢測到HBeAg陰性，但具有更高的HBV DNA復制活力。這主要是由HBV核酸突變導致HBeAg不表達或表達量下降引起，這些突變主要包括BCP區的1762/1764位點的雙突變和前C區的1896位點突變引起。BCP區是HBV前C區mRNA轉錄的重要元件，BCP區1762A→T1764G→A的聯合位點變異被認為可能阻礙前C區mRNA轉錄，從而造成HBeAg滴度下降或消失［6］。HBV前C區突變最常見的位點為nt 1896G-A的變異，使密碼28由色氨酸TGG變換成終止密碼TAG，導致HBeAg合成終止，在血清學上表現為HBeAg陰性，亞洲平均50%HBeAg陰性的慢性乙肝患者存在前C區突變。目前用于核酸位點突變檢測的方法主要有單鏈構象多態性分析技術、DNA直接測序、限制性內切酶分析、同位素標記寡核苷酸探針技術和微型DNA陣列［11～13］。其中測序法是運用較為廣泛和準確的方法，但也存在操作復雜、檢測周期長和檢測靈敏度較低的不足，對混合型30%以下的突變容易存在漏檢的現象。微型DNA陣列是新開發出來用于檢測多位點突變的方法，其主要優勢在于可同時檢測多個位點。

本研究采用錯配擴增和熒光PCR結合的突變分析法(MAMA-PCR)檢測HBV BCP區和前C突變，同時采用科研試劑盒和金標準測序法比對檢測結果的準確性。在進行樣本檢測比對之前首先對MAMA-PCR兩個檢測位點的試劑性能進行檢測與評估，檢測結果表明BCP區1762/1764和前C區1896位點基因突變檢測試劑的時間與批次的CV%均＜5%，重復性好，10份特異性參考品檢測均為陰性，證明反應特異性好，不存在交叉檢測，同時其檢測靈敏度可達到104IU/mL;對于感染混合型HBV樣本，本試劑可穩定檢測出1%突變含量的樣本。MAMA-PCR法樣本檢測1762/1764結果與試劑盒一致，1896位點多檢出1例樣本，這1例樣本的核酸含量較低，處于臨界范圍區間，故可認為結果基本一致;測序法兩個位點突變檢出率均低于MAMA-PCR和試劑盒，分析可能由于測序法對低于30%突變比例的樣本存在漏檢引起。測序法作為金標準對核酸位點的檢測具有直觀，高通量的優點，特別針對同一區間的多個突變，可一次性檢測出所有位點，在臨床上仍然具有不可替代的作用。但對于單位點的突變檢測，MAMA-PCR具有更高的靈敏度，檢測更為準確便捷。本研究采用MAMA-PCR方法針對1762/1764和1896位點開發的檢測試劑與已有試劑盒檢測結果無差異，豐富了HBV1762/1764和1896位點的檢測方案，將為HBV患者治療方案的制定提供依據。

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