β－淀粉樣蛋白與載脂蛋白E4對大鼠海馬突觸素的影響

崔麗霞，郭 鋒，李新毅

(1長治醫學院附屬和平醫院神經內科，長治 046000;2呂梁市人民醫院神經內科;3山西醫科大學附屬大醫院神經內科;*通訊作者，E-mail:xinyili2003@aliyun.com)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種原因未名的慢性進行性神經系統疾病，臨床特征為隱襲起病、持續進行性智能衰退而無緩解。研究表明Aβ在腦內的異常沉積是AD發病較為初始的因素。載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)在AD發生發展中所起的作用越來越受到關注。其結構基因存在多態性，基因型ε4是AD的高危因素和易患因素，ε4對應的蛋白質apoE4和Aβ的結合可能促進了AD的發生［1］。AD患者重要的組織形態學改變之一是突觸脫失，其程度與癡呆嚴重程度平行。突觸素(synaptophysin，SYN)作為突觸前終末的特異性標記物，可用來檢測突觸的密度和分布。我們首次采用海馬注射Aβ與ApoE4模擬AD的病理特征，并通過檢測SYN探索Aβ與ApoE4在AD發病機制中的作用及二者間是否存在協同作用。

1 材料和方法

1.1 材料

健康雄性Wistar大鼠24只，體重200－300g，鼠齡60 d。腦立體定位儀購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司。Aβ1－40購自中山生物工程有限公司。apoE4購自英國 Immunokontact公司。兔抗鼠突觸素單克隆抗體，二抗羊抗兔均購自武漢博士德生物工程有限公司。MIAS－2000圖像分析系統購自四川大學智勝軟件股份有限公司。

1.2 分組

24只大鼠腹腔注射D－半乳糖6周后，用隨機數字表法均分為4組:對照組雙側海馬注射生理鹽水，每側2 μl;Aβ 組雙側海馬注射5 μg/μl的 Aβ1－40，每側2μl;apoE4組雙側海馬注射0.5μg/μl的apoE4，每側2μl;Aβ+apoE4組雙側海馬注射每側10μg/μl Aβ1－401 μl+1 μg/μl apoE4 1 μl。

1.3 動物模型制備

以顆粒型普通大鼠飼料(含蛋白質23.00%、脂肪4.70%、鈉鹽0.24%)喂養，飲用自來水，動物房溫度控制在20℃左右，正常晝夜節律。首先予以腹腔注射D－半乳糖50 mg/(kg·d)6周致衰;之后海馬注射:10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，做顱頂正中切口，參照 George Paxinos的《The Rat Brain In Stereotaxic Cordinatcs》，在腦立體定位儀操縱下于前囟后3.0 mm分別向中線左右兩側旁開2.0 mm處，牙科鉆鉆開顱骨，5μl微量注射器自顱骨表面垂直進針4.0 mm，分別將生理鹽水、Aβ1－40、apoE4、Aβ1－40+apoE4混合液2 μl緩慢注入雙側海馬，術后保溫至清醒。

1.4 Morris水迷宮檢測

水迷宮測試實驗:海馬注射15 d后進行5 d定位航行試驗。水池被平均分為4個象限，將大鼠面向池壁放入水中，記錄每次試驗中大鼠從入水點到發現并爬上水下平臺的時間，為逃避潛伏期(escape latency，EL)。大鼠自由游泳最長時限120 s，大鼠120 s內未能發現平臺，就將其置于平臺上10s，此時的EL記為120 s。每1只大鼠一個上午或下午進行4次連續訓練，每次訓練間隔為60 s。1只大鼠1 d的EL的平均值就是平均逃避潛伏期(the average escape latency，AEL)。定位航行試驗后撤除平臺，在同一入水點將大鼠面壁投入水池，攝像機記錄其60 s內水中游泳路徑，電腦分析計算大鼠穿越平臺次數。

1.5 制備免疫組化切片

將大鼠用10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉，經左心室向升主動脈插管，剪開下腔靜脈，同時快速灌注肝素化生理鹽水(50 U/ml)120 ml(滴速為10 ml/min)以清除血管內血液，斷頭取腦，將大鼠海馬組織固定于4%的多聚甲醛溶液24 h后石蠟包埋，冠狀切片(厚度2－3μm)。

1.6 免疫組織化學檢測突觸素的表達

取石蠟切片采用SABC法檢測抗體的表達，步驟如下:①切片脫蠟;②滅活內源性酶;③熱抗原修復;④滴加5%BSA封閉液;⑤滴加稀釋的一抗突觸素(1∶200);⑥滴加生物素標記的相應的二抗;⑦滴加過氧化物酶標記的鏈霉素－親和素復合物(SABC);⑧抗原染色;⑨復染;⑩樹膠封片。

用MIAS－2000圖像分析系統測定海馬CA1區SYN的OD值。同時測定相應每張切片胼胝體OD值作背景，免疫反應物的OD值減去背景OD值得到校正OD值(COD值)，即免疫反應物的OD值。每例標本測5張切片，每張切片的每個測定部位隨機選取三個視野，取平均值。所有OD值測定均在相同的光學條件下完成。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 定位航行試驗

在5 d的定位航行實驗中，各組大鼠逃避潛伏期隨著游泳天數的增加有不斷縮短的趨勢(見表1，2)，表明各組大鼠在5 d的游泳訓練中對尋找平臺均有一定的學習記憶能力。從第5天大鼠的游泳軌跡圖可以看出，對照組大鼠很快能找到平臺位置，apoE4組大鼠運動軌跡多位于平臺所在象限，而Aβ組、Aβ+apoE4組大鼠多圍繞池壁游泳，在迷宮外環停留時間較長，較少游向平臺附近，其運動軌跡隨機分布于各象限中，以 Aβ+apoE4組更為明顯。apoE4組、Aβ組與對照組比較，大鼠第5天的逃避潛伏期明顯延長，差異有統計學意義(P＜0.01)。Aβ組與apoE4組比較，大鼠第5天的逃避潛伏期明顯延長，差異有統計學意義(P＜0.01)。Aβ與apoE4 之間存在交互作用(F=7.098，P＜0.01)，Aβ+apoE4組與Aβ組、apoE4組比較，大鼠第5天的逃避潛伏期均明顯延長，即二者具有協同作用。

表1 不同干預后大鼠第5天的逃避潛伏期(±s，s)Table 1 Changes of escape latency after different intervention at 5 d(±s，s)

表1 不同干預后大鼠第5天的逃避潛伏期(±s，s)Table 1 Changes of escape latency after different intervention at 5 d(±s，s)

不用43.50±9.78 10.75±2.44

表2 大鼠第5天的逃避潛伏期變化的析因設計方差分析Table 2 Variance analysis of escape latency after different intervention at 5 d

2.2 Aβ與apoE4對大鼠跨臺次數的影響

用2×2析因設計的方差分析法進行統計處理，結果顯示，apoE4組、Aβ組與對照組間比較，大鼠跨臺次數明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.01，見表3，4)。Aβ組與apoE4組比較，大鼠跨臺次數明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.01)。Aβ與apoE4 之間存在交互作用(F=7.230，P＜0.01)，Aβ+apoE4組大鼠跨臺次數均明顯少于單用Aβ組及單用apoE4組，即二者具有協同作用。

表3 不同干預后大鼠的跨臺次數(±s)Table 3 Changes of times of passing platform after different intervention(±s)

表3 不同干預后大鼠的跨臺次數(±s)Table 3 Changes of times of passing platform after different intervention(±s)

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表4 大鼠跨臺次數變化的析因設計方差分析Table 4 Variance analysis of times of passing platform after different intervention

2.3 各組大鼠海馬CA1區SYN OD值比較

apoE4和Aβ對大鼠海馬CA1區SYN免疫反應陽性產物的光密度值下降的主效應均有統計學意義(P＜0.01，見表5，6)，Aβ 與 apoE4 對 SYN 光密度值下降具有交互作用(P＜0.05);表明單獨用Aβ或apoE4均可導致海馬結構內CA1區SYN光密度值下降，并且兩者間存在交互作用。

表5 不同干預后大鼠海馬CA1區SYN OD值(±s)Table 5 Changes of optical density of synaptophysin in hippocampus CA1 region after different intervention(±s)

表5 不同干預后大鼠海馬CA1區SYN OD值(±s)Table 5 Changes of optical density of synaptophysin in hippocampus CA1 region after different intervention(±s)

不用0.551±0.032 0.759±0.043

表6 大鼠海馬CA1區SYN OD值析因設計方差分析Table 6 Variance analysis of optical density of synaptophysin in hippocampus CA1 region after different intervention

3 討論

Morris水迷宮可以檢測與海馬功能直接相關的空間學習記憶的形成和維持，被廣泛應用于神經生物學研究領域。我們采用Morris水迷宮測定各組大鼠學習能力發現:apoE4組、Aβ組與對照組比較，大鼠第5天的逃避潛伏期明顯延長、跨臺次數明顯減少;Aβ+apoE4組與Aβ組及apoE4組比較，平均潛伏期明顯延長、跨臺次數明顯減少，可見雙側海馬注射apoE4、Aβ、Aβ+apoE4均可使大鼠學習記憶能力下降，而Aβ與apoE4對學習記憶的損害具有協同作用。

AD是一種老年性疾病，人或者動物衰老時，智力水平及體內物質代謝、內環境穩態等均與年青時不同，因D－半乳糖長期注射，可以引起機體脂質氧化亢進，腦功能減退，轉錄水平減低，神經元RNA、蛋白總量下降，核固縮甚至神經細胞數目減少，故本實驗用長期大量注射半乳糖的方法來代替自然衰老鼠。

海馬直接參與信息的儲存與回憶，存在兩個回路與學習記憶有關，一個是經典的帕帕茲環路(Papez circle)，另一個是三突觸回路(trisynaptic circuit)。海馬→穹窿→乳頭體→乳頭丘腦束→丘腦前核→扣帶回→海馬，這條環路就是帕帕茲環路。三突觸回路即內嗅皮層通過穿通纖維與齒狀回顆粒細胞形成突觸聯系，而顆粒細胞發出苔狀纖維與CA3區錐體細胞形成突觸聯系，再由CA3區錐體細胞發出的Schaffer側支與CA1區錐體細胞形成突觸聯系。而CA1區錐體細胞發出纖維出海馬至下托，由下托發出纖維返回內嗅皮質。近年來的研究證實，三突觸回路具有特殊的機能特性，與學習記憶的形成密切相關［2］。已有研究證實，AD患者海馬結構內突觸素含量比正常人明顯減少［3］，故本實驗采用海馬注射方法。

突觸是神經元之間的連接點，是信息傳遞的基礎，多突觸連接形成神經回路。SYN是突觸囊泡膜上的特異性蛋白質，其胞質羧基末端可結合Ca2+，是突觸囊泡鈣結合蛋白之一，可被酪氨酸蛋白激酶磷酸化，對突觸囊泡的胞吐起重要作用［4］。SYN在神經元核周體的內質網合成，然后轉運到高爾基復合體進行加工，在囊泡中被運至突觸活化區，參與突觸囊泡的導入、轉運、神經遞質的釋放、突觸囊泡再循環和突觸發生。除了突觸囊泡外，線粒體、胞膜、突觸后膜均無突觸素。突觸素的減少意味著突觸囊泡轉運能力減弱，傳遞效能減弱。

Aβ的神經毒性作用已被證實。以往的研究表明，自然分泌的Aβ低聚物(oligomers)可以在生理水平明顯抑制大鼠海馬的突觸傳遞，提示可溶性Aβ低聚物可導致AD腦內突觸功能障礙和突觸丟失。我們采用海馬注射可溶性Aβ，結果顯示海馬注射可溶性Aβ后動物的學習記憶功能受損、大鼠海馬SYN OD值明顯下降。說明可溶性Aβ可以導致AD的重要病理特征即突觸受損及主要的臨床表現學習記憶功能受損。

apoE4對神經元的影響報道不多，有研究表明ε4基因型的個體與非ε4基因型的個體相比較，更易出現額葉局部萎縮［5］。本實驗結果提示，單純apoE4即可致SYN OD值下降，突觸囊泡轉運能力減弱，傳遞效能減弱，從而使動物的學習記憶功能受損。

我們通過在體Aβ聯合apoE4海馬注射的方法，并用析因設計方差分析證實 Aβ與apoE4對SYN OD的影響具有協同作用，說明apoE4有協同Aβ神經毒性效應的作用。這與細胞水平及國外研究相一致［6－8］。2000年郭文平等［6］在細胞水平的研究提示apoE4可能對Aβ神經毒具有協同作用。Smach等［7］研究提示AD患者中攜帶apoE4基因者腦脊液中 Aβ的含量比未攜帶者更低。在 APPV717F+/－轉基因小鼠體內的研究也發現，apoE以亞型特異性方式促進Aβ的沉積［8］。與apoE3個體相比較，apoE4的個體腦內高水平的Aβ低聚物可使樹突減少，加重記憶損害，導致AD患者近記憶力下降［9］。推測apoE4促進Aβ的沉積可能機制包括:①apoE4可以增加Aβ的形成［9］，使隨機螺旋結構變為片層結構，因而更易聚集成為纖維樣結構，產生淀粉樣斑塊。②apoE4與Aβ直接結合形成不易清除的復合物，能夠很強地穩定Aβ低聚物，這種改變導致AD［10］。③通過細胞內機制增加Aβ神經毒性。Aβ聯合apoE4海馬注射后，使更多Aβ進入細胞內，誘導其細胞內機制，促發一系列細胞毒性作用。

我們以海馬CA1區SYN作為檢測指標，用Aβ聯合apoE4注射于致衰大鼠海馬，模擬出AD的病理改變—突觸脫失及臨床特征—學習記憶功能障礙，提示apoE4有協同Aβ神經毒性效應的作用，其具體的相互作用機制尚待進一步深入研究。

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