丹參與黃芪配伍干預四氯化碳誘導大鼠肝損害的實驗研究

閻小女，王金茹，韓子巖

(1山西醫科大學第二臨床醫學院消化內科，太原 030001;*通訊作者，E－mail:rweiliaoshi@126.com)

肝纖維化［1］是慢性肝病最重要的病理特征，是各種慢性肝病演變成肝硬化的必經病理過程，是肝硬化和肝癌進一步發展的重要環節。目前多數抗肝纖維化治療仍處在實驗研究階段，臨床上缺乏高效、無毒副作用的抗肝纖維化藥［2］。傳統中藥抗肝纖維化方面具有優越性［3，4］，我們前期對我國抗肝纖維化中藥做了meta分析，得出眾多方劑均以丹參和黃芪作為君藥［5，6］。丹參和黃芪藥理作用不完全相同，理論上存在互補;兩藥配伍抗肝纖維化方面報道很少。此外在四氯化碳造模過程中易出現以肝細胞脂肪沉積為特征的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)病理改變。故本研究通過動物實驗來觀察丹參和黃芪對CCl4誘導的大鼠肝臟纖維化以及NAFLD活動度的干預作用。

1 對象和方法

1.1 實驗方法

將32只Wistar雄性大鼠，體重(200±20)g，隨機分為5組:正常對照組2只，模型組6只，丹參組8只，黃芪組8只，丹參+黃芪組8只。除正常對照組外，余30只大鼠均給予背部皮下注射40%四氯化碳橄欖油混合液0.3 ml/100 g體重，2次/周，共8周，正常對照組則給予等量的生理鹽水。中藥劑量按照成人有效劑量(60 kg體重給藥30 g)的8倍給藥;藥物干預組分別給予相應藥物灌胃干預持續8周。殺鼠取大鼠肝右葉組織分別行HE染色和Masson染色。

1.2 病理學判定

肝細胞脂肪變、炎癥和氣球樣變參照非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)標準［7］具體如下:脂肪性肝病(NAFLD)評分為NAS(nonalcoholic fatty liver disease activity score):①肝細胞脂肪變:0分，＜5%;1分，5%－33%;2分，34%－66%;3分，＞66%。②小葉內炎癥(20倍鏡計數壞死灶):0分，無;1分，＜2個 ;2分，2－4個;3分，＞4個。③肝細胞氣球樣變:0分，無;1分，少見;2分，多見。NAS(1、2、3項合計)＞4分則可診斷NASH;無小葉內炎癥、氣球樣變和纖維化，但肝脂肪變＞33%者為NAFL，脂肪變達不到此程度者僅稱為肝細胞脂肪變。

1.3 肝臟膠原纖維測量

應用Image Pro Plus(IPP)6.0專業圖像分析軟件對Masson染色圖片中的膠原纖維進行測量，所選測定指標面積(area)和積分光密度(IOD)。Masson染色的觀察:灰色區域主要為膠原纖維。光鏡下200倍隨機選取3－4個不重疊視野，用Olympus DP 71顯微攝像系統拍攝照片，用IPP軟件進行膠原纖維定量分析，分析每個組織片上膠原纖維的面積(area)及積分吸光度值(IOD)。

1.4 統計方法

2 結果

2.1 組織病理結果

2.1.1 肝組織HE染色 正常組肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊，肝板以中央靜脈為中心呈放射狀排列，未見脂肪變性、炎癥和壞死。模型組可見粗大纖維索、假小葉形成，肝細胞出現脂肪變，部分氣球樣變，散在少許炎癥細胞浸潤。與模型組相比，丹參組和黃芪組纖維素纖細，肝細胞脂肪變、炎細胞浸潤和氣球樣變無明顯差別。與丹參組和黃芪組相比，丹參+黃芪組肝纖維素數量少更纖細，而肝細胞脂肪變、炎性浸潤、氣球樣變差別不大(圖1，見第545頁)。

2.1.2 肝組織Masson染色結果 正常組肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊，未見纖維條索。模型組可見粗大纖維索、多個假小葉形成。與模型組相比，丹參組和黃芪組纖維素數量少且更細，假小葉形成減少。與丹參組和黃芪組相比，丹參+黃芪組肝纖維素數量少更纖細，假小葉形成不明顯(圖2，見第545頁)。

圖1 五組8周大鼠肝組織光鏡下HE染色結果 (×200)Figure 1 HE staining of liver tissues in five groups at week 8 (×200)

圖2 五組8周大鼠肝組織光鏡下Masson染色結果 (×200)Figure 2 Masson staining of liver tissues in five groups at week 8 (×200)

2.2 非酒精性脂肪性肝炎評分(NAS)

模型組、丹參組、黃芪組、丹參+黃芪組四組NAS評分與正常對照組相比均有升高(P＜0.05)，而這四組間兩兩比較評分差異無統計學意義(P＞0.05，見表1)。

表1 五組大鼠NAS比較結果Table 1 Comparison of NAS among five groups

2.3 膠原纖維的測量結果

模型組的膠原纖維指標面積(area)和積分光密度(IOD)較正常對照組均升高(P＜0.05)，3個藥物組的肝纖維面積和IOD值與模型組比較均降低(P＜0.05)，丹參+黃芪組分別與丹參組與黃芪組比較，肝纖維面積和IOD數值均更低(P＜0.05)。但丹參組與黃芪組的面積和IOD比較，差異無統計學意義(P＞0.05，見表2)。

表2 大鼠肝組織膠原纖維測量值結果(±s)Table 2 Comparison of area and IOD of collagenous fibers among five groups(±s)

表2 大鼠肝組織膠原纖維測量值結果(±s)Table 2 Comparison of area and IOD of collagenous fibers among five groups(±s)

與正常對照組比較，ΔP＜0.05;與模型組相比，*P＜0.05;與丹參 +黃芪組相比，#P＜0.05

丹參 +黃芪組 22 6.36±1.92* 2.38±1.10*F 103.085 56.505 P＜0.001＜0.001

3 討論

從20世紀70年代開始國內外學者把中國傳統草藥作為抗肝纖維化的突破口［8］，目前中藥抗肝纖維化已成為國內防治肝纖維化研究的熱點，已發現有效的抗纖中草藥達50余種［9］，對慢性肝炎、肝纖維化及早期肝硬化，中醫治療多以活血化瘀為主，兼以益氣補虛和養血柔肝。我們前期對國內六大抗肝纖維化成方進行meta分析，得出前述六方的交集藥味為丹參和黃芪，且丹參和黃芪是抗肝纖維化的有效中草藥［5，6］，前期動物實驗研究也表明丹參和黃芪治療肝纖維有效［10］。

本實驗丹參組的膠原纖維面積和IOD測量結果較模型組低，說明丹參是有效的抗肝纖維化草藥。丹參［11］的有效化學成分主要分為脂溶性的二萜醌類和水溶性的酚酸類，前者包括丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮、丹參甲酯、丹參新酮、二氫丹參酮Ⅰ、次甲丹參酮等，后者主要包括丹參素、原兒茶醛、丹參酸B等。現代藥理研究、臨床觀察及動物實驗表明丹參有顯著抗肝纖維化作用［12，13］，可抑制HSC的增殖和膠原的合成，促進膠原的降解、改善肝臟內血液微循環、增加肝內源性SOD活性，清除氧自由基，減低肝臟脂質過氧化反應、促進肝細胞的修復、抑制炎癥及炎性因子釋放起到抗肝纖維化作用。CCl4引起肝纖維化最重要原因是自由基及其脂質過氧化，故抗脂質過氧化損傷可起到抗纖維化并保護肝細胞作用。

本實驗黃芪組的膠原纖維面積和IOD測量結果較模型組低，說明黃芪可減輕肝臟內膠原纖維成分沉積，它是有效的抗肝纖藥。黃芪［14］化學成分主要包括為多種黃酮類、三萜皂苷類、多糖類、多種氨基酸、維生素和微量元素等。黃芪［14，15］通過增強肝星狀細胞間質性膠原酶的基因表達而促進沉積膠原的降解，能抑制成纖維細胞合成細胞外基質(ECM)、降低血清轉化生長因子β1、保護肝細胞膜、抗脂質過氧化及抗氧自由基。

本研究還發現丹參+黃芪組膠原纖維表達均少于丹參組和黃芪組，說明丹參和黃芪兩藥聯合抗肝纖維化優于單藥的作用，可能與兩藥抗肝纖維化的不同途徑互補有關。但前述兩藥對非酒精性脂肪性肝炎的活動度(NAS)無影響。關于中藥抗肝纖維化深入而準確的機制，需要我們進一步探索;加之中藥成分復雜，有效成分的提純和分析是未來需要深入研究的重點方向。

［1］Ismail MH，Pinzani M.Reversal of liver fibrosis［J］.Saudi J Gastroenterol，2009，15:72－79.

［2］王寶恩.當前抗肝纖維化研究的若干動向［J］.中華肝病雜志，2006，14(3):167－168.

［3］王美玲，陸倫根.肝纖維化治療研究進展［J］.實用肝臟病雜志，2013，16(4):369－371.

［4］Wang Xuanbin，Feng Yibin，Wang Ning，etal.Recent progress on anti-liver fibrosis candidates in patents of herbal medicinal products［J］.Recent Pat Food Nutr Agric，2012，4:91－106.

［5］李娜，李海玲，郝立然，等.復方中藥治療慢性病毒性肝炎肝纖維化的Meta分析和重要組分及有效成分［J］.臨床醫藥實踐，2012，21(6):407－416.

［6］郝立然，李娜，李海玲，等.復方中藥治療慢性病毒性肝炎肝纖維化 Meta分析［J］.臨床醫藥實踐，2011，20(7):494－497.

［7］中華醫學會肝臟學分會脂肪肝和酒精性肝病學組.非酒精性脂肪性肝病診療指南［J］.中國肝臟病雜志，2010，2(4):43－47.

［8］王美玲，陸倫根.肝纖維化治療研究進展［J］.實用肝臟病，2013，16(4):369－371.

［9］郝立然.中藥治療慢性病毒性肝炎肝纖維化的Meta分析以及納入中藥與交集藥味治療前后肝纖維化血清指標觀察［D］.太原:山西醫科大學，2011.

［10］李海玲，閻小女，韓子巖.國內六大名方交集藥味大鼠肝纖維化實驗研究［J］.臨床醫藥實踐，2013，22(8):605－607.

［11］趙娜，郭治昕，趙雪，等.丹參的化學成分與藥理作用［J］.國外醫藥·植物藥分冊，2007，22(4):155－160.

［12］陳岳祥，李石，范列英，等.丹參單體IH764－3抗肝纖維化作用的實驗研究［J］.中華醫學雜志，1998，78(8):636－637.

［13］Lin YL，Lee TF，Huang YJ，etal.Antiproliferative effect of Salvianolic acid A on rat hepatic stellate cells［J］.J Pharm Pharmacol，2006，58(7):933－939.

［14］丁繁，王小虎.中藥黃芪抗腫瘤研究進展［J］.腫瘤學雜志，2013，19(1):64－68.

［15］韓濤，王寶恩，錢紹誠，等.黃芪對肝星狀細胞膠原降解基因表達的影響［J］.天津醫科大學學報，2003，9(2):159－161.