TNF-α基因－238位點單核苷酸多態性與宮頸癌以及HPV感染的關系

尉春艷，彭慧霞，張 熙，孫學軍，張 菊，高艷娥

(1西安交通大學醫學院第二附屬醫院婦產科，西安710004;2西安交通大學醫學院第一附屬醫院普外科;3西安交通大學醫學院第二附屬醫院神經外科;4第四軍醫大學基因診斷技術研究所;*通訊作者，E-mail:weichy1023@163.com)

宮頸癌(cervical cancer)是女性生殖系統最為常見的惡性腫瘤之一，在發展中國家的婦女癌癥死因中占88%［1］。自20世紀80年代以來，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)與宮頸癌的關系越來越明確［2］，世界衛生組織已經于1996年確認HPV是宮頸癌的主要病因。但是HPV感染并不是宮頸癌的唯一致病原因，70%以上的HPV感染具有一過性，病毒可在6－8個月內被清除，只有大約20%的高危型HPV感染會長期持續存在，導致浸潤性宮頸癌的發生，HPV感染的持續化與宮頸癌發生的危險性增高有關［3］。因此，有效的免疫環境能夠監視并清除HPV感染，減少宮頸癌的發生。基因差異可影響機體免疫反應，可能決定了宮頸癌變的危險性大小。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)是一種多效性的免疫因子，在病毒的免疫清除中具有重要作用［4］，TNF-α基因的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)具有生物學上的重要性，可以影響TNF-α的產量和活性，從而可能從基因水平影響疾病的易感性。本實驗采用模板介導的染料終止物摻入－熒光偏振檢測(TDI－FP)的方法研究探討了TNF-α基因－238位點的單核苷酸多態性與宮頸癌以及HPV感染的關系。

1 材料與方法

1.1 組織標本

宮頸癌患者58例，平均年齡(46.8±9.7)歲，主要來源于西安交通大學醫學院第一、二附屬醫院、陜西省腫瘤醫院婦科，其中原位癌8例、Ⅰ期14例、Ⅱ期27例、Ⅲ－Ⅳ期9例;對照組22例，平均年齡(42.7±7.2)歲，包括11例宮頸炎和11例正常宮頸者，其中1例宮頸炎標本因取樣少無法檢測多態性予以剔除，宮頸炎標本均經過臨床確診且巴氏涂片檢查未見癌變跡象;正常宮頸組織來源于因非惡性腫瘤原因行子宮全切而且術后病理檢查確診無宮頸癌變的宮頸組織。

1.2 主要試劑、儀器

TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶(大連TaKaRa公司);Wizard? PCR Preps DNA Purification System、pGEM?－T Easy Vector SystemⅠ(美國Promega公司);GenEluteTMPlasmid Miniprep Kit(美國Sigma公司);DH5α菌株(第四軍醫大學全軍基因診斷研究所提供);96微孔板(美國MJ Research公司);PCR擴增儀、熒光偏振檢測儀、熒光偏振檢測試劑盒(美國PerkinElmer公司)。根據GenBank收錄的TNF-α基因序列設計包含TNF-α－238位點的引物和 TDI探針，擴增片段長189bp，P1:5’－gttagaaggaaacagaccacagacc－3’，P2:5’－ggacacacaagcatcaaggataccc－3’，TDI探針:5’－aagacccccctcagaatc－3’，P2:5’－tccccatcctccctgctc－3’，由上海生工生物技術有限公司合成。

1.3 陽性對照的建立

用酚/氯仿法粗提 DNA，測 OD 值，取 5.0μl DNA，加入上、下游引物各 1.0 μl，0.5 μl Taq 聚合酶，2.5 μl MgCl2，1.5 μl dNTPs，2.5 μl 10×Buffer，11.0μl雙蒸水，按照以下擴增條件:95℃ 5 min;94℃ 30 s，54 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，總共 35 個循環，72℃ 10 min進行PCR基因擴增，取10μl PCR反應產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，參照 Wizard?PCR Preps DNA Purification System核酸純化試劑盒說明書回收DNA片段。取3.0μl回收產物，1.0μl T4 DNA連接酶，1.0μl pGEM－T載體，2×T4連接酶緩沖液5.0μl，參照pGEM?－T Easy Vector SystemⅠ試劑盒說明書進行連接反應。5.0μl的連接產物與100μl的DH5α感受態細菌混合培養過夜，連續收集共10 ml菌液的菌體，參照 GenEluteTMPlasmid Miniprep Kit質粒提取試劑盒說明書提取質粒DNA，由上海生工生物技術有限公司測序鑒定。

1.4 TDI－FP法檢測－238位點的多態性

組織標本初步處理后，PCR基因擴增(反應體系、條件同1.3 中的 PCR)，取 PCR 產物15.0 μl，加入以1∶9的比例預先混合的PCR Clean-up Reagent和 PCR Clean-up Dilution Buffer 6.0 μl，37 ℃水浴 2 h后95℃4 h，以消化PCR反應中剩余的引物和dNTPs;消化后的產物7.0μl加入已配好的摻入反應混合物(0.5 μl點突變檢測探針，1.5 μl Acyclopol Terminator MIX，0.05 μl Acyclopol聚合酶，2.0 μl 10×Buffer，8.95 μl去離子水)13.0 μl，95 ℃ 變性2 min，94 ℃ 15 s，49 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，總共30 個循環，15℃延伸10 min，以摻入檢測點突變的探針;將摻入產物10μl加入96孔微孔板，置于熒光偏振檢測儀Victor2 Multi Label Counter中進行FP檢測。利用熒光偏振分析軟件“SNP Macro Victor 384 v 4.0”來分析檢測結果。

1.5 統計學分析以及遺傳平衡檢驗

利用擬合優度χ2檢驗的方法檢驗基因型頻率是否符合 Hardy Weinberg遺傳平衡定律。利用SPSS11.5進行 χ2檢驗，以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR擴增以及多態性檢測

以宮頸癌組織和宮頸炎分泌物中提取的DNA為模板，以預先設計的特異引物擴增包含待測位點的目的片段，取擴增產物10μl進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下觀察，與TNF-α基因－238位點對應的擴增產物為一條位置大約在190 bp的清晰條帶，與預先設計的擴增片段長度接近(189 bp)(圖1)。提取的質粒測序結果顯示:重組質粒中含有包含待測位點的目的序列，序列長度與預先設計的相同(189 bp)，與Genbank發表的已知序列同源。在后續的多態性檢測中采用與此序列對應的模板DNA作為陽性對照。對TNF-α基因－238位點進行多態性檢測，共檢測到兩個等位基因G、A，3個基因型:GG、GA、AA，其中G為優勢等位基因，GG基因型為優勢基因型。各基因型的檢測結果示例見圖2(GG為高TAMRA、低R110;GA為高TAMRA、高R110;AA為低TAMRA、高R110;對照:低TAMRA低R110)。

圖1 包含－238位點的擴增片段(189 bp)電泳結果Figure 1 The electropherotyping results of fragment including－238

圖2 TDI－FP法檢測TNF-α基因－238位點基因型Figure 2 Detection of all genotypes of－238 of TNF-α gene by TDI－FP

2.2 Hardy Weinberg遺傳平衡檢驗

TNF-α基因－238位點等位基因頻率已達遺傳平衡，說明本實驗研究資料具有較好的人群代表性。

2.3 宮頸癌與HPV感染的關系

所有宮頸癌標本中共41例完成HPV檢測，HPV陽性 36例(陽性率為 87.8%)，陰性 5例。HPV16型感染陽性率為68.3%(28例)，HPV18陽性率為14.6%(6例)。

2.4 TNF-α基因－238位點多態性與宮頸癌的關系

TNF-α基因－238位點三種基因型的分布在宮頸癌和對照組之間沒有顯著性差異(P＞0.05)，但是AA基因型在宮頸癌組為8.6%，對照組沒有出現。兩個等位基因G和A在兩組之間也沒有顯著性差異(P＞ 0.05，OR=1.448，95%CI 0.685－3.064，見表1)。

2.5 TNF-α基因－238位點多態性與HPV感染的關系

同時檢測HPV感染和－238位點多態性的患者中，HPV陽性者36例，HPV陰性者10例。TNF-α基因－238位點各等位基因的分布在HPV感染組與HPV感染陰性組之間非常相似，G等位基因在感染陽性和陰性組中分別為83.3%和85.0%，A等位基因在感染陽性組和感染陰性組分別為16.7%和15.0%，兩個等位基因的分布在兩組之間無顯著差異(P＞0.05，OR=1.111，95%CI 0.347－3.559，見表2)。

表1 TNF-α基因－238位點多態性在宮頸癌和對照組中的分布Table 1 Frequency distribution of TNF-α－238 polymorphisms in cervical cancer group and control group

表2 TNF-α基因－238位點多態性在HPV感染陽性組和陰性組中的分布 例(%)Table 2 Frequency distribution of TNF-α－238 polymorphisms in HPV positive group and nagative group cases(%)

3 討論

宮頸癌在中國每年有大約132 300例新發病例，位列女性惡性腫瘤的第二位［6］。高危型HPV已經被確認為宮頸癌的主要致癌原，尤其是HPV16型和18型。本研究中利用TDI－FP的方法檢測了41例宮頸癌組織的HPV感染情況，發現HPV感染陽性率高達87.8%，其中，高危型16型感染陽性率為68.3%，高于美國(59.5%)、非洲(42.5%)、歐洲(65.1%)［7］。由此可見，HPV 感染在不同國家和地區間存在一定的差異。

絕大多數疾病的發生發展都是遺傳因素與環境因素相互作用的結果，人類基因組是一個高度變異的體系，多態性的存在導致了個體之間的表型不同，個體在基因構成上的內在差異可以從一定程度上闡明人體對疾病、毒物的易感性與耐受性、疾病臨床表現的多樣性以及治療效果的差異。基因多態性的研究不但可以揭示同一種疾病不同臨床表型的實質，也可以為更具個體化的預防、診斷以及治療疾病打下基礎。有關基因多態性在臨床醫學中的應用已日益廣泛，包括臨床醫學的各個專業、各類疾病。一項meta分析表明:caspase－8的基因多態性與結直腸癌的易感性有關［8］。UGT2B17多態性與罹患前列腺癌的風險增高有關［9］。TNF-α基因－238位點的單核苷酸多態性與疾病的相關性被廣泛研究［10－12］，其機制可能與堿基突變后影響轉錄因子的結合，進而影響了TNF-αmRNA的表達并最終導致TNF-α的產量改變有關。研究發現－238位點G置換為A與TNF-α 的產量下降相關［13］，攜帶－238A 的外周血細胞經刺激后TNF-α的產量明顯下降［14］。

鑒于TNF-α在免疫清除方面的重要作用及宮頸癌與病毒感染持續化的密切關系，TNF-α基因的多態性與宮頸癌的關系近幾年受到關注。有研究發現，TNF-α基因－238位點 G→A多態性與宮頸癌的風險性降低有關［15－16］，本實驗中此位點的各基因型、等位基因與宮頸癌的易感性未見明顯關聯，分析原因可能為:①基因的多態性在不同種族人群中的分布并不一致，導致本實驗結果與其他種族結果的不一致;②樣本量少，導致突變所致的A等位基因及AA基因型的數值太少，無法反映此位點多態性的真實情況，故后期研究宜盡量增大樣本量。

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