環二鳥苷酸（c-di-GMP）作為潛在免疫佐劑的研究進展

叢曉燕，時建立，孫文博，李 俊，杜以軍，吳家強，陳 蕾，陳 智，王金寶?

（1：山東省農科院畜牧獸醫研究所，濟南250100；2：山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南250100）

隨著基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗及DNA疫苗研究的興起，人們發現新型疫苗有許多優點，但它們的抗原高度純化，常常不能誘導產生較強的免疫應答，很多情況下，即使接種了疫苗，仍然會有一定的發病率或死亡率，因此亟需研發新的疫苗或者有效地疫苗佐劑以提高疫苗的免疫效果。目前，要使新型疫苗的缺點得到彌補，最常用的方法是以適當的佐劑與之配合使用。傳統獸用疫苗中常用的佐劑有鋁鹽佐劑和油佐劑，但均存在一定的缺陷，如鋁鹽佐劑其在誘導細胞毒性T細胞及Th1型反應中作用很有限，同高純度的小分子蛋白抗原共同使用時不能引起足夠的抗體應答，因此鋁鹽在新型疫苗中的佐劑效果較差，但鋁鹽佐劑也是目前應用最廣的佐劑［1］。油佐劑疫苗在抗體效價和免疫持久性方面都優于鋁鹽佐劑，但其不良反應較嚴重。如弗氏佐劑在注射后易產生局部持久性潰瘍和肉芽腫。目前的研究熱點細胞因子［2］、脂質體［3］、CpG-ODN 佐劑［4-6］、單磷酰基脂質 A［7］四類新型獸用疫苗佐劑，是得到學者們公認的毒副作用較小而佐劑作用相對較好的有應用前途的佐劑。此外還有近幾年引起廣泛關注的細菌第二信使環二鳥苷酸與TOLL樣受體［8］，主要是刺激與調節機體先天免疫。環二鳥苷酸（cyclic diguanylate，c-di-GMP）是細菌中普遍存在的第二信使分子，參與調節多種生理功能，研究發現環二鳥苷酸作為免疫調節劑作用于真核細胞可產生很好的免疫調節作用，實驗研究表明其有可能成為具有潛力的疫苗佐劑［9］。本文著重介紹環二鳥苷酸作為免疫佐劑的研究。

1 c-di-GMP的結構與代謝

環二鳥苷酸是細菌中保守的第二信使分子，參與調節多種生理功能，包括細菌的運動，定置，分化、生物被膜形成、致病因子產生，細胞間通信等［10］。c-di-GMP是由2分子GTP縮合形成的環狀二核苷酸，其結構如圖1所示。細胞內c-di-GMP合成與降解代謝分別受二鳥苷酸環化酶（diguanylate cyclase ，DGC）和磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）調控，DGC和PDE活性中心為GGDEF和EAL結構域，GGDEF結構域能夠將2分子GTPs催化合成一分子c-di-GMP，而EAL結構域能夠將c-di-GMP降解為pGpG。

圖1 c-di-GMP的化學結構及其類似物

2 c-di-GMP的免疫特性與作用機理

c-di-GMP對某些嚴重的細菌感染有著驚人的保護效果，Karaolis等［11］利用小鼠模型感染肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），發現 c-di-GMP通過協同作用，可顯著降低肺臟中細菌濃度。該實驗同時證明，c-di-GMP的抗菌作用，是由于c-di-GMP的免疫調節，而非直接的殺菌作用。免疫調節作用不僅限于機體系統免疫反應，其在采用滴鼻的免疫方式時也可產生一系列的免疫調節作用，而消滅部分入侵的細菌。Ogunniyi AD與Yan H在研究以小鼠為模型感染肺炎球菌的治療時均證明，在滴鼻初始的保護療效對呼吸道病原體盡管沒有直接殺菌作用，但能顯著降低肺部的細菌濃度和減少傳播［12-13］，也間接說明c-di-GMP是通過免疫調節作用降低了細菌的感染。

c-di-GMP可刺激機體的先天免疫是一種有效的免疫調節劑。c-di-GMP確實有強大的免疫刺激特性，能夠初步刺激人未成熟樹突狀細胞表面組織相容性復合物MHCⅡ類抗原的表達，刺激分子CD 80／CD 86和成熟標志CD 83，增加分泌細胞因子和趨化因子（白細胞介素-12，干擾素-γ等），調節激活正常T細胞表達和分泌，并改變表達趨化因子受體。此外，c-di-GMP可增強細胞刺激活動［12-14］。 Yan H 等［13］證明 c-di-GMP 經腹腔注射或滴鼻免疫小白鼠，可誘導單核細胞、粒性白細胞、樹突細胞的聚集、增強T細胞活化的協同調節因子CD40和CD80的表達，且c-di-GMP滴鼻免疫小鼠24 h后，肺部樹突狀細胞數量明顯增加。

c-di-GMP有很好的免疫保護效果，但其作用機理近期才得以初步了解。先天免疫系統組成了機體對抗致病菌的第一道防線。當有致病菌入侵機體時，先天免疫系統中的模式識別受體可以感受致病菌中的一些核苷酸類的保守結構，從而激活機體合成多種細胞因子包括I型干擾素來對抗病原菌。病原菌侵入機體細胞后，在遺傳物質復制的過程中，會有游離的雙鏈DNA（dsDNA）釋放到胞內，而這些外源的DNA會引起細胞的免疫反應。在這個過程中，干擾素刺激因子 STING（stimulator of interferon gnens）跨膜蛋白起著重要的作用，它能夠促進干擾素的產生，并且在dsDNA從被檢測出到TBK-IRF3的信號通路中起著連接作用。2011年9月，Burdette等［15］人發現，STING 在病原菌和病毒感染時角色不同：既是病原菌所分泌的第二信使c-di-GMP的感受因子（sensor），又是宿主感知病毒核酸產生I型干擾素反應的信號接頭分子（adaptor）。

針對細菌的入侵，STING蛋白能夠直接感應環二鳥苷酸的信號分子，從而激活下游信號轉導通路，進而產生細胞因子及其它固有免疫反應。2012年，蘇曉東［16］通過對STING及其與c-di-GMP復合物結構的解析，非常清楚地展示了STING感受和結合c-di-GMP的分子機制，為進一步的免疫治療，及c-di-GMP作為疫苗佐劑的開發應用提供了非常重要的線索。同時，谷立川［17］揭示了先天免疫相關蛋白STING與細菌信號分子c-di-GMP的相互作用關系，STING以對稱二體的形式存在，形成一個適合結合c-di-GMP的具有對稱性的疏水腔；結合c-di-GMP后，STING的一個單體的β2-β3 loop會發生構象變化，這個構象變化能夠讓STING二體更緊密地結合c-di-GMP。這種結合方式與細菌蛋白結合c-di-GMP有著很大差別，前者主要以疏水相互作用為主，而后者則主要通過兩個精氨酸的正電荷與c-di-GMP兩個磷酸基團的負電荷的相互吸引結合在一起。這為理解內源免疫系統如何感應及防御微生物的感染提供了重要信息，也從分子水平上證明c-di-GMP可以作為優良的疫苗佐劑，在臨床上具有很好的應用前景。

3 c-di-GMP作為免疫佐劑的研究

c-di-GMP刺激和調節宿主的先天免疫反應表明，c-di-GMP及其類似物可以是一個潛在的疫苗佐劑，2006年第一次由Karaolis［14］正式的提出這一概念。 隨后，2007年 Ebensen T［18］首次評估了c-di-GMP及其類似物作為佐劑的可能性。采用標準的免疫程序模式抗原半乳糖苷酶與c-di-GMP的混合物皮下免疫小鼠，和單免抗原相比，其產生很強的體液免疫與細胞免疫，引起淋巴細胞增殖和干擾素，IL-2，IL-4和腫瘤壞死因子等的分泌。血清中檢測出IgG1與IgG2a亞型和脾細胞中細胞因子，說明 c-di-GMP作為疫苗佐劑可以誘導Th 1、Th 2平衡免疫反應，c-di-GMP可以作為好的疫苗佐劑。Hu DL等［19］建立小鼠感染模型，小鼠在2周的時間內間隔免疫三次，以鋁膠或c-di-GMP作為佐劑，1：1混合抗原耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，粘附素或金黃色葡萄球菌腸毒素。實驗表明以c-di-GMP作為佐劑的疫苗免疫的小鼠有更好地存活率，與鋁膠佐劑相比，脾臟與肝臟細菌的感染量明顯降低。另一小鼠模型，肺炎球菌PdB+c-di-GMP佐劑與肺炎球菌PdB+鋁膠佐劑相比產生較高的特異性抗體，且產生很好的免疫保護［12］。

c-di-GMP在作為全身免疫佐劑研究的同時，發現其作為粘膜佐劑有著不錯的免疫效果。Yan H等［20］首次證明c-di-GMP作為佐劑，可提高粘膜免疫反應，產生針對病菌入侵的保護性免疫。小鼠通過滴鼻免疫肺炎球菌表面黏附素A與c-di-GMP的混合物可刺激機體產生特異性抗體IgA、IgG1和IgG2a。粘膜和血清中的含有較高的特異抗體肺炎球菌表面黏附素A。McWhirter SM等［21］在哺乳動物細胞漿中發現c-di-GMP，其引發的轉錄反應與細胞內的DNA刺激機體產生的反應相似，通過調控基因TANK激酶1，干擾素調整因子3，核因子B和有活性的蛋白激酶，引發誘導產生Ⅰ型干擾素。這個反應與胞漿DNA引發的反應一樣，可能會增加c-di-GMP作為小分子佐劑的價值。Madhun AS等［22］利用植源性的流感疫苗 H5N1，混合c-di-GMP作為佐劑。采用滴鼻或肌注的方式免疫小鼠，以肌注的方式免疫的小鼠沒有提高H5N1的免疫應答，而以滴鼻方式免疫的小鼠引起強烈的粘膜免疫與體液免疫，另外，滴鼻的方式引起 Th1／Th2的平衡變化，出現大量多功能的Th1CD4細胞，說明c-di-GMP對植源性的流感疫苗H5N1是一種很有前途的粘膜佐劑。Pedersen GK等［23］應用小鼠模型免疫H5N1減毒活疫苗，混合c-di-GMP作為佐劑，采用滴鼻、舌下注射與肌注的方式免疫小鼠。舌下免疫可有效地誘導局部與全身的體液免疫和細胞免疫反應，但免疫效果明顯低于滴鼻免疫，但高于肌注免疫。值得一提的是舌下免疫可產生大量針對H5N1的特異多功能CD4+細胞。三種免疫方式均產生了較高的血凝抑制抗體，其中唾液中的HI抗體僅由滴鼻與舌下注射免疫產生。通過對比一系列的免疫方式，滴鼻免疫的方式是最能提高c-di-GMP免疫效果的免疫方式，這也間接證實c-di-GMP作為佐劑，在粘膜免疫方面具有很好的效果。與目前佐劑研究的熱點細胞因子，脂質體，CpG-ODN佐劑，單磷酰基脂質 A相比c-di-GMP可以明顯提高抗體IgG1、IgG2a，干擾素-γ的水平與含量［24］。

4 結語

c-di-GMP能夠刺激機體產生免疫反應，而啟動了探討其作為新型免疫增強劑的研究，新型疫苗佐劑一般具有來源廣泛、價格低廉、高效低毒、作用機理研究比較清楚等特點［25-26］。c-di-GMP要成為切實可行的免疫佐劑還需大量的數據支持：體外的實驗表明c-di-GMP對正常大鼠腎細胞或人類神經母細胞瘤細胞沒有致死毒性，也沒有不良的反應或是致癌作用［14-20］，但在體內的安全性需要進行評估；c-di-GMP強大的免疫刺激特性可能導致對機體有害的炎癥反應［27］，這就需要對c-di-GMP進行結構修飾防止過度組織炎癥。粘膜表面（如呼吸道，消化道和泌尿生殖道）是病原菌主要的入侵途徑和定居部位。因此，發展佐劑和疫苗引起有效和持續的粘膜免疫反應，防止病原體的附著，入侵和復制，將在預防和治療許多重要的傳染病方面起到重要作用。c-di-GMP能否成為一種有效地粘膜佐劑必須經過更多方面的評估。另外，對c-di-GMP的作用機制的深入研究，是c-di-GMP成為粘膜免疫佐劑關鍵的一步。雖然，c-di-GMP或其相關衍生物成為切實可行的免疫佐劑任重而道遠，但其值得期待。

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