布魯氏菌病補(bǔ)體結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)抗體檢測試劑盒敏感性和特異性評價(jià)

王 楠，姚學(xué)軍，馬立峰，王秀麗，程君生，蔣玉文，趙心力，毛開榮*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081;2.北京市昌平區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京102200;3.內(nèi)蒙古動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，呼和浩特010010)

布魯氏菌(Brucella)是一種嚴(yán)重威脅人類健康的重要人畜共患病原菌，可感染人、多種家畜和野生動(dòng)物，引起發(fā)熱、流產(chǎn)與不育、慢性關(guān)節(jié)炎及神經(jīng)損傷等病癥［1］。布魯氏菌病(布病)不但對動(dòng)物的繁殖和生產(chǎn)性能構(gòu)成嚴(yán)重危害，更重要的是，人感染布魯氏菌后，往往難以治愈，造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。近十年來，布病在我國死灰復(fù)燃，畜群和人間布病感染率逐年上升［2-5］，再次嚴(yán)重地威脅著我國公共衛(wèi)生事業(yè)和畜牧業(yè)發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)室建立的補(bǔ)體結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法是一種既保持了補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)高特異性，又兼具ELISA高敏感性的布魯氏菌病免疫學(xué)檢測技術(shù)［6］，本實(shí)驗(yàn)室在該方法的基礎(chǔ)上研制了商品化的試劑盒。為了評價(jià)布病CF-ELISA試劑盒的敏感性、特異性及其與其他商品化抗體檢測產(chǎn)品的符合率，本試驗(yàn)對經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)的感染地區(qū)牛、羊群血清，凈化地區(qū)牛、羊血清進(jìn)行抗體檢測，同時(shí)與虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、間接ELISA(iELISA)抗體檢測試劑盒和膠體金檢測試紙條(CGS)進(jìn)行了敏感性、特異性和產(chǎn)品間的比較分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 血清樣品為從內(nèi)蒙古自治區(qū)經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)的感染地區(qū)采集的牛、羊血清各200份，凈化地區(qū)采集牛、羊血清各100份，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

CF-ELISA試劑盒由本實(shí)驗(yàn)室制備(批號(hào):201301)。虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原(批號(hào):201301)、布病陽性血清(批號(hào):201301)和陰性血清(批號(hào):201202)均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)制備、鑒定和保存;iELISA試劑盒購自IDEXX公司(批號(hào):p06906);CGS購自韓國 BIONOTE公司(批號(hào):2303038)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 本實(shí)驗(yàn)為了評價(jià)CF-ELISA試劑盒的敏感性，檢測了感染地區(qū)采集的各200份牛、羊血清樣品的布病抗體;為了評價(jià)CF-ELISA試劑盒的特異性，檢測了凈化地區(qū)采集的各100份牛、羊血清樣品的布病抗體;同時(shí)用其他三種產(chǎn)品對上述血清樣品進(jìn)行了布病抗體的檢測，將CFELISA試劑盒的檢測結(jié)果與其他三種產(chǎn)品進(jìn)行了比較，上述四種產(chǎn)品的實(shí)驗(yàn)方法如下:

1.2.1 CF-ELISA試劑盒 待檢血清作1∶10稀釋加入到包被好的檢測板中，100 μL/孔，同時(shí)設(shè)立陽性、陰性和空白對照，室溫孵育30 min。洗滌液250 μL/孔，洗滌4次;加入1∶40稀釋的豚鼠補(bǔ)體，100 μL/孔，室溫孵育30 min。洗滌4次后加入1∶1600稀釋后HRP標(biāo)記抗豚鼠補(bǔ)體C3抗體，100 μL/孔。室溫孵育30 min。繼續(xù)洗滌4次后，加入底物顯色液，室溫避光顯色10 min;每孔加入終止液50 μL，酶標(biāo)儀測定450 nm處光吸收值(OD值)。結(jié)果判定:試驗(yàn)成立條件為陽性對照血清OD450nm的平均值應(yīng) ＞0.60，陰性對照血清的OD450nm的平均值應(yīng)＜0.30。樣品的S/P(%)值＝100×(待檢樣品OD450nm值-空白對照OD450nm的平均值)/(陽性對照血清OD450nm的平均值-空白對照OD450nm的平均值)≥0.25，即為陽性。

1.2.2 虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原 按照說明書進(jìn)行:備一塊潔凈玻璃板，畫成若干個(gè)約4 cm2的小格。在方格中滴加被檢血清和布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原各一滴(約0.03 mL)，等量混合均勻，在4 min內(nèi)讀取結(jié)果，同時(shí)做布病陽性血清和布病陰性血清對照。每份被檢血清在規(guī)定時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集反應(yīng)者判為陽性(+)，不出現(xiàn)凝集反應(yīng)者為陰性(-)。

1.2.3 iELISA試劑盒 按照說明書進(jìn)行:待檢牛、羊血清作1∶10倍稀釋加入到包被好的檢測板中，200 μL/孔，同時(shí)設(shè)立陽性和陰性對照，室溫孵育1 h，洗滌液300 μL/孔，洗滌 3 次;加入 1∶200倍稀釋的酶標(biāo)抗體，100 μL/孔，室溫孵育30 min，洗滌液300 μL/孔，洗滌3次;加入底物顯色液，室溫避光顯色20 min;每孔加入終止液50 μL，酶標(biāo)儀測定450 nm處光吸收值(OD值)。結(jié)果判定，陽性對照血清OD450nm的平均值應(yīng)≥0.35，且陽性對照孔OD450nm的平均值/陰性對照孔OD450nm的平均值應(yīng)≥3.0時(shí)，測定結(jié)果有效。樣品的S/P(%)值＝100×(樣品OD450nm值-空白對照OD450nm的平均值)/(陽性對照OD450nm的平均值-空白對照OD450nm的平均值)≥120%，即為陽性，否則110% ＜S/P(%)＜120%，為可疑或S/P(%)≤110%為陰性。

1.2.4 膠體金吸附試紙條 按照說明書進(jìn)行:取1滴血清樣品加入檢測孔中，加入3～4滴樣品稀釋液，10 min后肉眼觀察結(jié)果。結(jié)果判定，C線處出現(xiàn)紅線時(shí)試驗(yàn)成立，T線處出現(xiàn)紅線時(shí)即為陽性，否則為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用x2檢驗(yàn)(McNemar法)統(tǒng)計(jì)分析敏感性差異是否顯著。采用Kappa一致性檢驗(yàn)方法，按照 Landis和 Koch［7］等建立的劃分標(biāo)準(zhǔn)判定一致性。

2 結(jié)果

2.1 CF-ELISA試劑盒對感染地區(qū)牛血清樣品抗體檢測結(jié)果及與其他產(chǎn)品的敏感性和符合率比較

對200份經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)的感染地區(qū)牛血清樣品，CF-ELISA試劑盒RBT、iELISA試劑盒和CGS檢測結(jié)果的比對分析可以得出:CF-ELISA試劑盒相對于RBT、iELISA試劑盒和CGS的敏感性分別為51%、86%和81%。CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS的符合率分別為80%、95%和93%(表1)。

Kappa一致性檢驗(yàn)分析表明，CF-ELISA試劑盒和iELISA試劑盒檢測結(jié)果κ值＞0.81，具有極高度的一致性，CF-ELISA試劑盒和CGS檢測結(jié)果κ值＞0.61，具有高度的一致性。各產(chǎn)品間檢測結(jié)果的Mc-Nemar檢驗(yàn)表明，CF-ELISA試劑盒與iELISA試劑盒和CGS的敏感性差異均不顯著(P＞0.05)。

表1 CF-ELISA試劑盒對感染地區(qū)牛血清樣品抗體檢測結(jié)果及與其他產(chǎn)品的敏感性和符合率比較

表2 CF-ELISA試劑盒與其他產(chǎn)品比較敏感性和符合率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 CF-ELISA試劑盒對凈化地區(qū)牛血清樣品的檢測結(jié)果及與其他產(chǎn)品的特異性和符合率比較對100份經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)的凈化地區(qū)牛血清樣品，CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS檢測結(jié)果的比對分析可以得出，CF-ELISA試劑盒相對于RBT、iELISA試劑盒和CGS的特異性均為100%。CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS的符合率均為100%(表3)。

表3 CF-ELISA試劑盒對凈化地區(qū)牛血清樣品的檢測結(jié)果及與其他產(chǎn)品的特異性和符合率比較

2.3 CF-ELISA試劑盒對感染地區(qū)羊血清樣品的檢測結(jié)果及與其他產(chǎn)品的敏感性和符合率比較對200份經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)的感染地區(qū)羊血清樣品，CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS檢測結(jié)果的比對分析可以得出，CF-ELISA試劑盒相對于RBT、iELISA試劑盒和CGS的敏感性分別為44%、70%和57%。CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS的符合率分別為80%、89%和85%(表4)。

Kappa一致性檢驗(yàn)分析表明，CF-ELISA試劑盒和iELISA試劑盒檢測結(jié)果κ值＞0.6(表5)，具有高度的一致性。各方法間的McNemar檢驗(yàn)結(jié)果表明，CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒、CGS的敏感性和符合率差異均不顯著(P＞0.05)。

2.4 CF-ELISA試劑盒對凈化地區(qū)羊血清樣品的檢測結(jié)果及與其他產(chǎn)品的特異性和符合率比較對100份經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)的凈化地區(qū)羊血清樣品，CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS檢測結(jié)果的比對分析可以得出，CF-ELISA試劑盒相對于RBT、iELISA試劑盒和膠體金試紙條的特異性均為100%。CF-ELISA試劑盒與 RBT、iELISA試劑盒和CGS的符合率均為100%(表6)。

表4 CF-ELISA試劑盒對感染地區(qū)羊血清樣品的檢測結(jié)果及與其他產(chǎn)品的敏感性和符合率比較

表5 CF-ELISA試劑盒與其他產(chǎn)品比較敏感性和符合率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表6 CF-ELISA試劑盒對凈化地區(qū)羊血清樣品的檢測結(jié)果及與其他產(chǎn)品的特異性和符合率比較

3 討論

3.1 目前我國的布病防治工作，按照畜間布病發(fā)生和流行程度，將全國分為布病重度流行區(qū)、輕度流行區(qū)和凈化區(qū)，對不同流行區(qū)分別采取不同措施管理，并實(shí)施分類指導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)通過對感染地區(qū)和凈化地區(qū)分別進(jìn)行敏感性和特異性的比較分析得出，在感染地區(qū)CF-ELISA試劑盒與iELISA試劑盒和CGS敏感性無顯著差異，在凈化區(qū)CF-ELISA試劑盒與RBT、iELISA試劑盒和CGS特異性也無顯著差異。而且，CF-ELISA方法與作為OIE推薦的國際貿(mào)易的iELISA方法之間具有高度的一致性。上述結(jié)果表明，CF-ELISA試劑盒是一種可以篩選感染地區(qū)陽性動(dòng)物，同時(shí)也可以監(jiān)測凈化地區(qū)是否有布病感染的快速、高通量血清學(xué)檢測方法。

3.2 由于標(biāo)記抗體的種屬特異性制約了iELISA試劑盒、cELISA試劑盒和CGS等產(chǎn)品只能檢測特定動(dòng)物的血清，本實(shí)驗(yàn)中采用的商品化試劑盒和試紙條在檢測牛和羊血清時(shí)分別使用的是檢測相應(yīng)血清的兩種試劑盒。CF-ELISA方法特點(diǎn)在于補(bǔ)體參與了抗原抗體反應(yīng)，針對補(bǔ)體制備的標(biāo)記抗體無種屬特異性，所以CF-ELISA試劑盒可以同時(shí)檢測牛血清和羊血清，而且兩種血清的檢測結(jié)果顯示，CF-ELISA試劑盒分別和兩種iELISA試劑盒檢測結(jié)果都具有高度的一致性。理論上推測，CFELISA試劑盒同樣可以應(yīng)用于豬血清、狗血清和其他野生動(dòng)物的布病抗體檢測，這些有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

3.3 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究工作中，用于評估兩種檢測方法檢測結(jié)果是否一致的統(tǒng)計(jì)方法很多，例如:x2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和貝葉斯評估法等，事實(shí)上這些統(tǒng)計(jì)方法都存在局限性和不足，在某些情況下甚至應(yīng)用不同的統(tǒng)計(jì)方法對同一資料進(jìn)行分析可能得出完全相反的結(jié)論。本研究采用x2檢驗(yàn)中配對計(jì)數(shù)資料的McNemar檢驗(yàn)法分析兩種方法之間檢測結(jié)果的差異顯著性;采用Kappa一致性檢驗(yàn)分析兩種方法之間的一致性，而且根據(jù)參考判斷指標(biāo)能對一致性分析“量”值化［7，9］，同時(shí)應(yīng)用這兩種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可以更科學(xué)地評價(jià)本研究中的產(chǎn)品。當(dāng)然，實(shí)驗(yàn)中檢測血清的樣本數(shù)量對統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果有影響，為了進(jìn)一步評價(jià)CF-ELISA試劑盒的敏感性和特異性，合理擴(kuò)大檢測樣本的數(shù)量將是下一步的研究重點(diǎn)。

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