禽白血病病毒p27蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和多克隆抗體的制備

毛婭卿，王 嘉，吳 濤，王 哲，蔣桃珍

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

禽白血病是由禽白血病/肉瘤群病毒引起的禽的多種腫瘤性疾病的總稱［1］。1997和1998年，J亞群禽白血病在世界范圍內(nèi)爆發(fā)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2-3］。目前該病尚無徹底可行的防治措施，主要是通過病原檢測淘汰陽性雞以凈化種群［4-5］。

禽白血病病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白包括核心蛋白(gag)、酶蛋白(pol)和囊膜蛋白(env)。核心蛋白中的p27蛋白分子量為27 kD，為主要的群特異性抗原［6］。在禽白血病/肉瘤群病毒的檢測試驗(yàn)中，均以p27作為抗原制備群特異性抗體，從而建立相應(yīng)的病毒檢測方法［7-8］。本實(shí)驗(yàn)室前期利用電泳方法提取p27蛋白，制備兔抗p27多克隆抗體，并成功研制了禽白血病病毒 ELISA抗原檢測試劑盒［9］。但此方法分離提取的p27蛋白，產(chǎn)量少，成本較高，不利于該試劑盒的商品化生產(chǎn)與應(yīng)用，目前該試劑盒為實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)。因此我們在前期實(shí)驗(yàn)室工作的基礎(chǔ)上，擬利用大腸桿菌表達(dá)p27蛋白并制備兔抗p27多抗，從而建立成熟穩(wěn)定適合于規(guī)模化生產(chǎn)的p27蛋白及兔抗p27多抗的生產(chǎn)和純化工藝。

1 材料與方法

1.1 病毒和酶標(biāo)抗體 禽白血病病毒(RAV-1株、RAV-2株)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所供。辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗p27抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雞胚和4月齡新西蘭大耳白兔均購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑及試劑盒 克隆質(zhì)粒載體pMDl8-T、T4 DNA連接酶、IPTG、RT-PCR 試劑盒，購自大連寶生物工程有限公司;工程菌DH5a、BL21(DE3)、原核表達(dá)載體pET-28a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存;RNA提取試劑盒、DNA凝膠回收提取試劑盒購自TIANGEN公司;His TrapTMkit、HiTrap rProtein G HP 購自 GE healthcare公司;弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)均為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所供。

1.4 p27基因的克隆

1.4.1 病毒的增殖 取10日齡SPF雞胚按標(biāo)準(zhǔn)方法制備雞胚成纖維細(xì)胞(約106個(gè)/mL)，分裝到25 cm2瓶中，8 mL/瓶，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h形成單層后接種RAV-1、RAV-2株毒液(10倍稀釋)0.1 mL，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱21 d。在此期間每隔5～7 d傳代一次，共傳代2次，病毒液于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 病毒總RNA的提取 取經(jīng)ELISA檢測呈陽性的細(xì)胞，吸取上清，用RNA提取試劑盒提取病毒總RNA。

1.4.3 引物設(shè)計(jì)及RT-PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank上發(fā)表的 p27序列，設(shè)計(jì)下列引物:上游引物:5’-GGATCCGCCATG CCTGTAGTGATT-3’，下游引物:5’-GTCGACCTAGGGCTGGATAGCAGAC-3’。用上述引物進(jìn)行一步法RT-PCR反應(yīng)，在保持閱讀框架不變的前提下，上游引物引入BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物引入SalI酶切位點(diǎn)，反應(yīng)條件為50℃ 30 min，95℃預(yù)變性5 min，然后94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán);最后72℃反應(yīng)10 min。

1.4.4 重組克隆載體pMD-p27的構(gòu)建與鑒定RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。將純化的RT-PCR產(chǎn)物與pMD-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，送英駿生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果的序列拼接、校正和分析使用DNA Club、PrimerPremier5及基于Internet上的BLAST分析軟件。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將測序正確的重組質(zhì)粒用BamH I和Sal I雙酶切獲得p27基因片斷，表達(dá)載體pET-28a(+)也用相同的酶消化，回收并純化。p27基因與雙酶切的表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5a中，然后用菌液進(jìn)行PCR和酶切鑒定，得到重組的表達(dá)質(zhì)粒pET28a-p27。

1.6 重組p27質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定 將雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pET28a-p27轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL2l(DE3)，挑選生長良好的陽性單菌落37℃活化過夜，轉(zhuǎn)接種于LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)2～3 h(OD600nm至0.6～0.8)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，30℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，4℃ 5000 r/min離心15 min，棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)菌沉淀。將收取的菌體用pH 7.4的PBS離心洗滌3次，懸于10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶液，超聲破菌，4℃12000 r/min離心10 min收集上清。離心沉淀再次用PBS重懸，上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.7 p27蛋白在大腸桿菌中的大量表達(dá)與純化將上述陽性菌液轉(zhuǎn)接5 mL于500 mL的LB培養(yǎng)基中低溫誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體超聲破碎后上清利用金屬螯合柱進(jìn)行純化、洗脫、收集蛋白，進(jìn)行SDSPAGE分析。

1.8 兔抗p27蛋白多克隆抗體的制備、ELISA和SDS-PAGE檢測

1.8.1 兔抗p27血清的制備 將純化的p27蛋白溶液與弗氏完全佐劑以1∶1混合乳化后，對試驗(yàn)兔進(jìn)行背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射免疫。兩周后再用純化的p27蛋白溶液與弗氏不完全佐劑以1∶1混合乳化后，對試驗(yàn)兔進(jìn)行背部多點(diǎn)皮下及肌肉注射免疫。二免后兩周再以同樣的方法進(jìn)行第三次免疫。三次免疫不同時(shí)間后經(jīng)耳緣靜脈采血分離血清，然后用純化后的p27蛋白檢測血清抗體效價(jià)。血清效價(jià)滿足試驗(yàn)要求即可采血分離血清。

1.8.2 多克隆抗體的純化 采集的兔抗p27抗血清利用HiTrap rProtein G HP(GE)進(jìn)行純化、洗脫、收集蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果 RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增的片段約為740 bp(圖1)，與預(yù)期大小相符。

圖1 p27基因的RT-PCR擴(kuò)增

2.2 重組克隆載體pMD-p27的構(gòu)建與鑒定 將擴(kuò)增片段克隆到pMD-18T載體，經(jīng)BamH I/Sal I雙酶切，消化得2650 bp和740 bp的片段(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符，將重組質(zhì)粒命名為pMD-p27。

圖2 重組克隆載體pMD-p27的酶切鑒定

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒(pET28a-p27)的雙酶切鑒定 重組質(zhì)粒(pET28a-p27)經(jīng)BamH I及Sal I雙酶切后，電泳可見到兩條大小分別為5369 bp和740 bp的條帶(圖3)，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖3 重組表達(dá)載體pET28a-p27的酶切鑒定

2.4 p27蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)，挑取陽性克隆接種LB培養(yǎng)基中，IPTG 30℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，菌體處理后進(jìn)行SDS-PAGE分析，約在27 kD處有1條明顯的誘導(dǎo)蛋白條帶。結(jié)果說明目的蛋白主要以可溶性蛋白的形式在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(圖4)。

圖4 融合蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

2.5 表達(dá)蛋白的Western blot鑒定 Western印跡分析表明，在誘導(dǎo)上清中出現(xiàn)約27 kD的反應(yīng)帶(圖5)，與融合蛋白的分子量大小基本一致，表明已經(jīng)成功表達(dá)p27蛋白。

2.6 表達(dá)蛋白的純化 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-p27上含有6個(gè)組氨酸，利用鎳離子金屬螯和柱純化大腸桿菌表達(dá)的6 His-p27融合蛋白，用不同濃度的咪唑進(jìn)行洗脫，SDS-PAGE結(jié)果表明獲得了理想的純化產(chǎn)物(圖6)。

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析

圖6 表達(dá)蛋白的純化

2.7 兔抗p27蛋白抗體的效價(jià)測定 以p27蛋白免疫前的兔血清做對照，用ELISA法測定抗體效價(jià)。抗體效價(jià)為大于最高OD值的50%所對應(yīng)的血清稀釋度。結(jié)果顯示，二免后1周兩只兔子的血清效價(jià)均達(dá)1∶12800(表1);三免后1周兩只兔子的血清效價(jià)均達(dá)1∶25600(表2)。

2.8 兔抗p27蛋白抗體的純化 采集的兔抗p27血清利用HiTrap rProtein G HP(GE)進(jìn)行純化、洗脫、收集蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果為單一條帶(圖7)，表明所采用的柱層析方法適合于兔血清IgG的純化。

圖7 兔抗P27抗體的SDS-PAGE分析

表1 二免后1周ELISA檢測血清OD值

表2 三免后1周ELISA檢測血清OD值

3 討論

禽白血病病毒其核心蛋白中的p27蛋白是主要的群特異性抗原，對于禽白血病的診斷有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)室前期將大量的ALV細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)超速離心濃縮和純化后，首次在國內(nèi)通過電泳分離法制備了高純度、具有較好的抗原活性的p27蛋白，并成功制備兔抗p27抗體，但是由于禽白血病病毒在細(xì)胞上增殖滴度低，獲取大量的病毒液比較的費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于規(guī)模化生產(chǎn)p27蛋白。利用大腸桿菌表達(dá)目的蛋白具有成本低、周期短，操作簡便，表達(dá)蛋白可大量生產(chǎn)、易于純化等諸多優(yōu)點(diǎn)，因而普遍為人們所采用。因此，我們克隆了禽白血病病毒p27基因，成功構(gòu)建pET28a-p27重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后高效的表達(dá)目的蛋白。雖然其質(zhì)粒上帶有組氨酸標(biāo)簽，但由于其分子量小，生理?xiàng)l件下不帶電荷，而且免疫原性較差，在體內(nèi)不易產(chǎn)生抗體，試驗(yàn)結(jié)果表明該標(biāo)簽對目的蛋白的結(jié)構(gòu)與功能影響很小。由于目的蛋白帶有組氨酸標(biāo)簽，使蛋白的純化工藝簡單，容易滿足目的蛋白的大規(guī)模純化。

大腸桿菌表達(dá)ALV的p27重組蛋白具有良好的免疫原性，免疫家兔后可產(chǎn)生高效價(jià)的抗p27血清，ELISA效價(jià)達(dá)1∶25600，這與電泳純化病毒p27蛋白免疫家兔所產(chǎn)生的抗體效價(jià)基本一致。因此采用大腸桿菌表達(dá)p27蛋白制備抗體，為后續(xù)研制禽白血病病毒ELISA檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

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