富含羧基的多肽基雙親水雜化共聚物控制碳酸鈣的形成*

黃玉剛，褚曰環，何明輝，曾兆華，楊建文

(1.廣州醫科大學藥學院化學教研室，廣東廣州 510183;2.中山大學化學與化學工程學院//聚合物復合材料及功能材料教育部重點實驗室，廣東廣州 510275）

生物礦物質精確和高超的結構與功能都反映了生物大分子，尤其是蛋白質對其形貌、尺寸及晶體取向的控制作用。蛋白質與礦物質相互作用，扮演結構指導劑的角色。Addadi和 Morse［1－2］發現，軟體動物的可溶性殼蛋白對構成其外殼的CaCO3的晶型與取向起決定性作用。大自然這種神奇的功能激發了科學家們利用合成化合物來模擬生物大分子結構和功能的興趣。CaCO3是自然界最為廣泛存在的礦物質之一，它對生物有機體起著重要的作用。因此，利用合成材料來模擬CaCO3的生物礦化過程是目前的研究重點之一。CaCO3的生物礦化過程可用聚合物來模擬，例如明膠、己內酯－丙烯酸嵌段共聚物等［3－4］。盡管這些材料對 CaCO3晶體的取向或晶型等起到一定的調控作用，但是它們的本身結構卻與蛋白質完全不同?；诙嚯牡那抖喂簿畚锸歉鼮槔硐氲牟牧?，因為多肽和蛋白質一樣具有α－螺旋或 β－折疊的二級結構，分子組成也近似。Yu和Cofen［5－7］利用基于多肽的嵌段共聚物或共聚多肽來控制CaCO3在DMF相中的礦化，成績卓著。不過這些多肽結構比較簡單，側鏈的羧基含量也比較少，而且CaCO3在水相環境下的生物礦化更有意義。

本文中，結合N－羧基－環內酸酐開環聚合和“巰－炔”光點擊反應 (Thiol－Yne)制備了側鏈富含羧基的多肽基雙親水雜化共聚物，利用它來指導CaCO3在水溶液中的生物礦化，并探討多肽的濃度、構象如何對CaCO3的形貌、尺寸和晶型產生影響。多肽嵌段共聚物的制備過程如示意圖1所示，其中端氨基的聚乙二醇單甲醚 (PEO－NH2)為引發劑，γ－炔丙基－L－谷氨酸酯 (PLG－NCA)為開環單體，得到的聚合物記為PEO－b－PPLG;多肽側鏈的炔基在紫外光條件下用3－巰基丙酸 (MPA)改性，目標產物記為 PEO－b－PPLG－g－MPA。

圖1 PEO－b－PPLG－g－MPA 的合成路線Fig.1 A route for synthesis of polypeptide－based polymer of PEO－b－PPLG－g－MPA containing rich carboxyl groups

1 實驗部分

1.1 原料

3－巰基丙酸 (MPA)(w＞97%)和 ω－氨基 －聚乙二醇單甲醚 (PEO－NH2，Mn=5000 g/mol)購自Sigma－Aldrich，沒有進一步純化。透析袋 (相對分子質量為4000)使用前用熱水浸泡。N，N－二甲基甲酰胺 (DMF)加入氫化鈣過夜，蒸餾，加入0.4 nm分子篩保存備用。光引發劑UV651(2，2－二甲氧基－1，2－二苯乙酮)為工業級，用甲醇重結晶。紫外光光源采用中壓汞燈點光源，光照強度為20 mW/cm2。

1.2 樣品合成

1.2.1 PLG－NCA、PEO－b－PPLG 和 PEO－b－PPLG－g－MPA 的合成 PLG－NCA 根據文獻方法合成［8］。PEO－b－PPLG的合成是在反應瓶中將 PLG－NCA(0.8 g，3.70 ×10－3mol)用 4 mL DMF 溶解，N2鼓泡 20 min。再將溶有 0.2 g PEO－NH2的 2 mL DMF溶液用注射器注入。磁力攪拌下整個體系持續地通入N2，室溫條件反應3 d，整個過程用干燥裝置保護。反應結束后將溶液緩慢滴加到60 mL乙醚中沉淀出產物 PEO－b－PPLG，然后分別用乙醚、甲醇和水洗滌，減壓干燥。

將0.1 g PEO－b－PPLG 溶于1.5 mL DMF 中，然后按炔基和MPA比例為1∶4加入適量MPA。待聚合物完全溶解后再添加φ=5%的UV－651，室溫下用20 mW/cm2紫外光照射30 min。透析法提純產物，最終得到產物 PEO－b－PPLG－g－MPA。

1.3 測試和表征

1H NMR由Varian 300核磁共振儀采集，室溫下以DMSO－d6、CDCl3或 D2O為溶劑;GPC曲線由Waters高效凝膠色譜系統采集，PS柱子為固定相;CD采用JASCO－810圓二色譜儀在室溫條件下測定，首先將聚合物溶解在pH為12的水溶液中，然后稀釋至0.1 mg/mL，50 nm/min中速掃描，響應時間為1 ms，光徑為1 cm;由JSM－6330F冷場發射SEM觀察CaCO3形貌，將含有CaCO3顆粒的水滴在載玻片上，多余的水用濾紙吸干，然后放在干燥器內自然揮發，樣品測試前不經熱處理。XRD采用Rigaku D－MAX 2200 VPC粉末X射線衍射儀在室溫下收集，掃描速率8(°)/min。Cu Kα1激發，波長0.15406 nm，范圍20°～70°。CaCO3的尺寸由 Nano Measurer 1.2.5軟件統計。

1.4 CaCO3在水溶液中的生物礦化的模擬

在實驗室利用Na2CO3水溶液和CaCl2水溶混合的方法來模擬CaCO3的生物礦化過程，本實驗采用兩種方法，與Colfen［5］采用的方法類似。具體可分為雙注射法和單注射法，雙注射法具體過程為:先配制一系列濃度不同的5 mL聚合物水溶液，pH調整到10或12;然后向聚合物溶液中同時注入0.16 mL、0.5 mol/L的Na2CO3水溶液和同等體積、濃度的CaCl2水溶液，流速均為0.03 mL/min。注入完畢，在室溫下保持CaCO3結晶，定時取樣進行形貌分析;單注射法具體過程為:先配制一系列濃度不同的5 mL聚合物水溶液，pH調整到10或12;向聚合物溶液中注入0.16 mL、0.5 mol/L的CaCl2水溶液，室溫靜置12 h。此時再以0.03 ml/min的速度注入同等體積、濃度的Na2CO3水溶液，定時取樣進行形貌分析。

2 結果與討論

2.1 多肽基雙親水雜化共聚物的合成、表征及構象性質

圖2 PPLG 和 PEO－b－PPLG－g-MPA 的核磁圖Fig.2 1H NMR spectra of PEO－b－PPLG and PEO－b－PPLG－g-MPA

圖3 PEO 和 PEO－b－PPLG 的 GPC曲線Fig.3 GPC chromatograms of PEO and PEO－b－PPLG determined in DMF at 50 and in the presence of 0.1 mol/L LiBr

PEO－b－PPLG 采用 PLG－NCA 單體的開環聚合法，以數均相對分子質量為5000的PEO－NH2為大分子引發劑。MPA與側鏈炔基之間的Thiol－Yne點擊反應在365 nm的紫外光照射下，添加光引發劑UV－651輔助進行，目標產物記為 PEO－b－PPLG－g－MPA。一個炔基可以和兩個巰基分子發生反應，因此與傳統的聚谷氨酸基嵌段共聚物相比，明顯地增加了羧基含量。PEO－b－PPLG 和 PEO－b－PPLG－g－MPA的1H NMR見圖2所示，其中包含反應前后各個質子峰的位置。在圖3中PEO和PEO－b－PPLG的GPC曲線中后者為一單峰，表明成功合成了目標聚合物，Thiol－Yne點擊產物的具體表征見本課題組前期報導［8］。本方法具有“點擊”反應的特征，無須基團保護，提純簡單，效率高，最大的優勢是Thiol－Yne點擊反應無需使用銅鹽做催化劑，避免了銅鹽的生物細胞毒性。多肽鏈段的長度可以通過PEO－NH2和 PLG－NCA的質量比例來控制，當m(PEO－NH2)∶m(PLG－NCA)分別為 1∶200 和1∶250時，根據圖2中質子峰a和e的面積比，得到多肽組分的聚合度分別為170和224，因此經MPA 改性后的產物 PEO－b－PPLG－g－MPA 簡寫為 P170和 P224。PEO－b－PPLG 及 PEO－b－PPLG－g－MPA 的相對分子質量及其分布、Thiol－Yne效率等參數列于表1。Thiol－Yne反應非常高效，輻照10 min內，炔基的轉化率 (或巰基的接枝效率)即可超過92%［8］。PEO－b－PPLG 可以在 CHCl3、THF、DMF、DMSO 等溶劑中溶解。PEO－b－PPLG－g－MPA 在大部分常見溶劑中都不能夠溶解，不過在堿性水溶液中可溶，在DMSO中可以有限溶解。溶解度低的原因是多肽的螺旋構象導致其分子鏈非常僵硬，而且側鏈引入了的大量羧基，側鏈之間強烈的相互作用降低了其溶解性，這也從側面證明了Thiol－Yne反應的高效性。

表1 多肽基雜化共聚物的表征參數Table 1 Parameters for characterization of polypeptide－based hybrid copolymers

PEO－b－PPLG－g－MPA 中多肽鏈段的二級結構可由CD測定，其結果如圖4所示。不同pH條件下P170中的多肽鏈段采取的構象不一樣。當pH低于4.9時，酸性條件下出現的以222和208 nm為中心的兩個負Contton效應峰是多肽α－螺旋構象的特征峰，它們分別由n1－π*和π0－π*平行極化的激子躍遷所導致［9］。而當pH高于6.9時，以218 nm為中心的正的Contton效應峰是多肽呈無規線團的特征峰，說明此時多肽呈現無規線團二級構象。因此，CD光譜分析表明，pH低于4.9時，多肽采取α－螺旋構象，當水溶液pH繼續升高時，側鏈帶負電荷，側鏈間的靜電排斥導致螺旋構象解體，pH誘導多肽發生了構象轉變，慢慢轉變成無規線團狀，轉變區間是 4.9～6.9。由此可見，當用PEO－b－PPLG－g－MPA 做為蛋白質模板指導 CaCO3的生物礦化時，因CaCO3只能在堿性條件下存在，故多肽只能采取無規線團的二級結構。

圖4 不同pH條件下P170在水溶液中的CD曲線Fig.4 CD spectra of P170in aqueous solution with concentration of 0.1 mg/mL

2.2 CaCO3在水溶液中的形貌分析及其調控

2.2.1 肉眼觀察CaCO3的生物礦化過程 可以直接從表觀上觀察多肽對CaCO3礦化過程的影響。圖5給出了采用雙注射法時該混合體系的外觀。圖5(a，b，c)顯示，當1 min時，含有P170的水相體系呈現出稍許淡藍色，并無肉眼可見的顆粒出現(圖中白色物為攪拌子);3 min時該體系淡藍色比較明顯，不過仍無肉眼可見的固體顆粒出現，淡藍色暗示了顆粒的尺度在1000 nm以內;5 min后CaCl2溶液和 Na2CO3溶液同時滴加完畢，此時保持體系不再被攪動，60 min時有肉眼可見固體顆粒出現，底部有固體顆粒沉積，不過體系上層仍保持渾濁狀。而圖5(d，e，f)顯示，如若無P170，1 min時體系即出現肉眼可見顆粒，也沒有淡藍色;3 min時體系中已有大量固體顆粒;5 min后同樣保持體系不再被攪動，60 min時發現底部有大量固體顆粒沉積，體系上層澄清。這些直觀的實驗現象說明，多肽基雜化雙親水共聚物中的多肽組分的確對CaCO3晶核的形成和晶體生長有所影響，它延遲了晶核的形成和晶體的生長，至少在尺度上起到了指導作用。

2.2.2 CaCO3生物礦化過程中多肽濃度的影響

圖5 采用雙注射法肉眼觀察P170在水溶液中對CaCO3結晶形成的控制Fig.5 Visual inspection of biomineralization of CaCO3in aqueous solution in the presence or absence of P170，double－jet method

多肽作為CaCO3的礦化指導劑，其濃度可能會對CaCO3晶體的形貌有所影響，利用SEM可觀測各種多肽濃度條件下CaCO3的形貌。圖6(a，b，c，d)顯示了在pH為10時，改變多肽濃度，36 h后CaCO3晶體的形貌。在濃度為0～0.05 mg/mL區間，多肽失去了對CaCO3形貌的控制，因為從圖6(c)和6(d)中看出，0.008 mg/mL時，CaCO3晶體是典型的六面體，與不加多肽時 (0 mg/mL)的形貌一樣，六面體的尺度也都在1～8 μm之間。當濃度增加到0.05 mg/mL時，可以觀察到除了有六面體晶體，還有少量尺寸為1～2 μm的CaCO3微球出現，此時六面體的尺度也在1～2 μm之間(圖6(b))，比多肽濃度為0.008 mg/mL時的尺寸小了很多，這表明在該濃度下多肽已經對CaCO3的形貌、晶核的形成及生長有了一定程度的控制作用。而當濃度增加到1 mg/mL時，可以明顯觀察到一定數量的尺度在1.5～3.5 μm之間的 CaCO3微球，此時還有很多尺寸為幾百納米CaCO3顆粒，它們的邊緣鈍化成弧形。這說明多肽對CaCO3的形貌已經有較好的控制，也可以指導晶核的形成及其生長速度。有意思的是，濃度為1 mg/mL的條件下，結晶18 h時取樣觀察可看到有橄欖形的CaCO3出現，它們的長軸尺寸平均為 1.5 ～3.0 μm之間，平均約1.7 μm，與圖6(a)中的微球尺寸一致，這說明在0～36 h之內CaCO3并不是直接轉變成微球，而是從橄欖形過渡到球形。假若礦化過程時間足夠長，圖6(a)和6(f)中邊緣鈍化成弧形的CaCO3晶體小顆粒幾乎全部生長成微球狀，這將在下面論述。圖6(d)和6(e)分別是不含多肽的情況下結晶36 h和30 min后CaCO3的形貌，它們彼此之間并無差別，說明若無多肽，CaCO3的形貌始終為典型的六面體形，其尺寸也相近，故可知礦化過程無法得到調控。PEO－b－PPLG－g－MPA 由兩部分組成，PPLG－g－MPA可與礦物相互作用，PEO不與礦物相互作用，這種結構對CaCO3晶體的生長起模板作用。多肽側鏈的羧基陰離子對Ca2+有高度的親合性，為Ca2+提供結合點，使Ca2+濃度局部過飽和，加快成核過程出現。晶核形成后，PPLG－g－MPA鏈段與納米晶體的表面相互作用，選擇性地吸附在晶粒表面，而不同的PEO鏈段彼此纏繞，這樣的結構穩定納米晶粒并控制其生長［10］。多個納米晶體也可以形成無序或有序的聚集體，最終呈現出特定的形貌。不過聚合物模板形成并發揮調控作用的機理十分復雜，目前并無確定的結論。

圖6 采用雙注射法用SEM觀察可變條件下CaCO3的形貌Fig.6 SEM morphologies of CaCO3in variable conditions in pH=10 aqueous solution，double－jet method

2.2.3 CaCO3形貌的調控 大自然中由生物蛋白所控制的CaCO3形貌具有多樣性，因此本研究進一步探討我們所得到的多肽基雙親水雜化共聚物PEO－b－PPLG－g－MPA 對 CaCO3形貌的調控作用。圖7是可變條件下CaCO3的SEM照片。CaCO3形貌的調節可以通過改變雙親水雜化共聚物中多肽嵌段的長度來實現。在 pH為10、聚合物濃度為1.0 mg/mL的條件下，當多肽嵌段的長度為224個重復單元時，CaCO3呈棒狀，其長短不一，但橫截面尺寸平均為520 nm，如圖7(a)所示;同等條件下，降低多肽的長度至170個重復單元，CaCO3為表面光滑的微球，尺寸在1.0～3.7 μm 之間，平均約2.4 μm，結果如圖7(b)所示。改變體系的pH值，也可以調節CaCO3的形貌。如圖7(c)所示，保持多肽長度為170個重復單元，濃度同樣為1.0 mg/mL，當pH上升到12，CaCO3為超結構微球，其表面不再光滑，堆滿了片狀的CaCO3小顆粒。

圖7 在7 d后采用雙注射法觀察可變條件下后CaCO3的形貌Fig.7 Morphologies in CaCO3under variable conditions after 7 days，double－jet method

甚至改變CaCO3礦化過程的操作方法，也可以得到形貌多樣的CaCO3晶體。以上都是采用雙注射法，圖8展示了采用單注射法得到的CaCO3的形貌。如圖8(a)所示，當pH為10時，在P170濃度為1.0 mg/mL的條件下，24 h后單注射法得到的CaCO3呈“花瓣狀”，該“花瓣狀”聚集體由多根CaCO3納米棒聚集而成，而同等條件下雙注射法得到的CaCO3為表面光滑的微球 (圖8(b))。在pH為12、P224濃度為1.0 mg/mL的條件下，單注射法得到的CaCO3也是表面堆滿了小顆粒的超結構微球，這與圖7(c)中CaCO3的形貌一樣。由此可見，在pH較高的條件下，多肽鏈段的長度、結晶時間甚至注射方法式都不是影響CaCO3的主要因素，pH高，則多肽側鏈的羧基陰離子就較多，這個條件下可能對CaCO3形貌的控制作用就比較穩定，而其他影響因素則得到抑制。

圖8 在24 h后采用單注射法觀察可變條件下CaCO3的形貌Fig.8 Morphologies of CaCO3in variable conditions using single－jet method after 24 h

2.2.3 CaCO3的晶型 用XRD研究了所得到的CaCO3的晶型。CaCO3主要有三種晶型:方解石(calcite)、文石 (aragonite)和球霰石 (vaterite)，其中前兩者是最常見的穩定晶型，第三種是熱動力學不穩定晶型，在自然界中比較少見［1，11］。XRD(圖9)結果顯示，在實驗條件下所有的CaCO3都為方解石晶型，其最穩定的晶型。林嘉平等［12］用聚 (N－異丙基丙烯酰胺)－b－聚谷氨酸嵌段共聚物來調控CaCO3的生物礦化，可以得到不穩定的球霰石，其中聚合物膠束對CaCO3的晶型有重要影響。這里，我們制備的多肽基共聚物是雙親水的，堿性條件下并不形成膠束，因此CaCO3結晶過程主要受羧酸陰離子的控制，多肽的構象也可能調控晶核的生長［12］。

圖9 在7 d后CaCO3的XRD曲線Fig.9 XRD patterns of CaCO3after 7 days

3 結論

結合N－羧基－環內酸酐開環聚合和“巰－炔”點擊反應制備了側鏈富含羧基的多肽基雙親水雜化共聚物 (PEO－b－PPLG－g－MPA)。該多肽基共聚物可以模擬蛋白質指導CaCO3在水溶液中的形貌和尺寸。多肽可以有效地調控CaCO3的生物礦化，不過此時其為無規線團構象，而不是其更為有序的α－螺旋或β－折疊構象。CaCO3形貌是可控的，可以通過調整體系pH值、多肽長度等手段實現，其形貌可以是表面光滑微球、超結構微球、納米棒或呈“花瓣狀”聚集的納米棒。

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