溫度和pH對駝背鱸消化酶活力的影響*

劉江華，區又君，李加兒，吳水清

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所∥農業部南海漁業資源開發利用重點實驗室，廣東廣州 510300;2.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306）

消化酶是由消化系統分泌的起營養和消化作用的酶類，因反應底物不同而分為蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等幾種。消化酶活力是評價動物生理機能的重要指標之一，不同消化酶在動物機體中的分布隨消化器官不同而不同;同一種消化酶在不同消化器官中的分布也存在明顯差異;甚至同一消化器官中同一種消化酶，當外界環境因子改變時，其活力大小及分布也會發生改變。近年來，國內外對魚類消化酶的研究已有較多報道［1－4］，但關于外界環境因子對消化酶活力的影響的研究較少;溫度和pH是消化酶活力兩個重要環境因子，關于其對魚類消化酶活力影響的報道，國內已對卵形鯧鲹 (Trachinotus ovatus)［5－6］、黃鰭鯛 (Sparus latus)［7－8］、洞庭鯰魚 (Silnrus asotus)［9］、黑鯛 (Sparus macrocephalus)［10］、雜色鮑 (Haliotis diversicolor Reeve)等魚類進行了大量研究［11］。

駝背鱸 (Cromileptes altivelis)俗名老鼠斑，隸屬鮨科、石斑魚亞科、駝背鱸屬［12］。駝背鱸具有較高的食用和觀賞價值，分布在西太平洋和印度洋的熱帶地區，我國見于南海［13］。至今國外對駝背鱸的研究處于起步階段，國內的研究主要包括形態和生物學性狀［14］、引種馴養及人工誘導性腺發育和繁殖［15］、胚胎發育［16］、年齡與生長特征［12］、染色體核型分析［17］、腎臟、鰓絲、嗅囊、肝臟及腦垂體的組織學結構等［13，18－21］，關于駝背鱸消化系統的研究只見于對組織學與組織化學的觀察［22］，而對消化酶的研究尚未報道，因此本文通過溫度和pH對駝背鱸消化酶活力的影響，為其營養生理和消化吸收機能的深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚及馴養

實驗用魚共9尾，購自水產市場，體質量320.97～386.45 g，全長28.50～30.00 cm。實驗前在水溫24～25℃，鹽度27‰～28‰，pH 7.8～8.2的條件下馴養2 d;每天換水一次，換水量為80%，換水溫差≤1℃;連續充氣并保持溶解氧≥5 mg/L。

1.2 溫度和pH梯度實驗設計

1.2.1 溫度梯度實驗設計 設7個溫度梯度，在20～50℃范圍內以5℃為一個梯度，在pH 7.2的條件下在恒溫水浴鍋內分別測定每一個溫度下的酶活力。

1.2.2 pH梯度實驗設計 在pH為2.2～9.2的范圍內，以一個pH為幅度，設8個梯度，以37℃為反應溫度，分別測定每一個pH下的酶活力。

1.3 粗酶液制備

將停食24 h后的實驗魚處死并迅速在冰盤上進行解剖，取胃、腸、幽門盲囊、肝等消化器官，剔除附著的脂肪，用預冷 (4℃)的雙蒸水洗去內容物，用濾紙吸取表面的水分，稱量，剪碎并加入10倍體積的預冷 (4℃)雙蒸水，在冰浴的條件下用勻漿機高速勻漿，勻漿液放置于4℃的冰箱中靜置1 h，然后用高速冷凍離心機離心 (0～4℃，10000 r/min)30 min，離心后的上清液為粗酶液，將粗酶液置于4℃的冰箱中保存備用。

1.4 酶活力測定

參照區又君等［5］和范春燕等［23］的方法，測定蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及蛋白濃度的試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4.1 蛋白酶 每毫克組織蛋白在37℃的條件下1 min內水解酪蛋白質產生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位 (μg/min)。

1.4.2 脂肪酶 組織脂肪酶活力單位定義:在37℃條件下，每克組織蛋白在本反應體系中與底物反應1 min每消化 μmol底物為一個酶活力單位(μmol/min)。

1.4.3 淀粉酶 淀粉酶活力單位是組織中每毫克蛋白在37℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為一個淀粉酶活力單位 (mg/min)。

1.4.4 蛋白濃度 采用考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。

1.5 數據的處理與分析

實驗所得數據用統計分析軟件SPSS PASW Statistics進行處理，用軟件中的ANOVA和LSD分別進行差異顯著性比較和多重比較，(P＞0.05)不存在顯著性差異。 (P＜0.05)具有顯著性差異，(P＜0.01)具有極顯著性差異。

2 結果

2.1 溫度對消化酶活力的影響

2.1.1 溫度對蛋白酶活力的影響 圖1所示，在設定的溫度20～50℃范圍內，駝背鱸各消化器官的蛋白酶活力均隨著溫度的升高呈先升后降的趨勢。胃、腸、幽門盲囊和肝都在40℃時酶活力達到最高值，20℃時酶活力最低。胃蛋白酶在40℃和45℃不存在顯著性差異 (P＞0.05)，因此胃蛋白酶的最適溫度為40～45℃;其他部位蛋白酶的最適溫度均為40℃;各實驗溫度組的酶活力與該消化器官最適溫度的酶活力存在顯著性差異 (P＜0.05)和極顯著性差異 (P＜0.01)。

圖1 溫度對駝背鱸蛋白酶活力影響Fig.1 Effects of temperature on protease activity in C.altivelis

2.1.2 溫度對脂肪酶活力的影響 圖2所示，駝背鱸各消化器官在20～50℃溫度范圍內的脂肪酶活力均隨著溫度的升高呈先升后降的趨勢。胃脂肪酶的最適溫度為35℃，50℃時酶活力最低;其他部位在20℃時酶活力最低，腸和肝的脂肪酶最適溫度為40℃，幽門盲囊在40℃與45℃時的脂肪酶酶活力不存在顯著性差異 (P＞0.05)，因此40～45℃為幽門盲囊脂肪酶的最適溫度;各消化器官其他溫度的脂肪酶活力與最適溫度脂肪酶活力有顯著性差異 (P＜0.05)和極顯著性差異 (P＜0.01)。

2.1.3 溫度對淀粉酶活力的影響 圖3所示，駝背鱸胃淀粉酶的最適溫度為40℃，其他部位均為35℃;胃和肝淀粉酶在20℃時最低，與最適溫度之間存在顯著差異 (P＜0.05);腸和幽門盲囊淀粉酶在50℃時最低，與最適溫度之間存在極顯著性差異 (P＜0.01)。在設定的溫度范圍內，各消化器官的淀粉酶活力均隨著溫度的升高呈先升后降的趨勢。

圖2 溫度對駝背鱸脂肪酶活力影響Fig.2 Effects of temperature on lipase activity in C.altivelis

圖3 溫度對駝背鱸淀粉酶活力影響Fig.3 Effects of temperature on amylase activity in C.altivelis

2.2 pH對消化酶活力的影響

2.2.1 pH對蛋白酶活力的影響 圖4所示，在設定的pH 2.2～9.2范圍內，駝背鱸各消化器官蛋白酶活力均隨著pH的升高呈先升后降的趨勢。胃蛋白酶的最適pH為3.2，腸、幽門盲囊和肝的最適pH均為8.2;pH 9.2時胃蛋白酶最低，其他部位的最低值均在pH 2.2;各部位的最適pH的酶活力與其他pH組的酶活力之間存在顯著性差異 (P＜0.05)和極顯著性差異 (P＜0.01)。

2.2.2 pH對脂肪酶活力的影響 圖5所示，胃和肝脂肪酶的最適pH分別為7.2、8.2，腸和幽門盲囊的最適pH均為6.2，各部位在pH 2.2時酶活力最低;駝背鱸各消化器官脂肪酶活力在設定的pH范圍內均隨著pH的升高呈先升后降的趨勢;最適pH酶活力與其他各pH組間存在顯著性差異 (P＜0.05)和極顯著性差異 (P＜0.01)。

圖4 pH對駝背鱸蛋白酶活力影響Fig.4 Effects of pH on protease activity in C.altivelis

圖5 pH對駝背鱸脂肪酶活力影響Fig.5 Effects of pH on lipase activity in C.altivelis

2.2.3 pH對淀粉酶活力的影響 圖6所示，駝背鱸各消化器官淀粉酶活力在設定的pH 2.2～9.2范圍內均隨著pH的升高呈先升后降的趨勢。腸、幽門盲囊和肝淀粉酶的最適pH為7.2;胃淀粉酶在pH 7.2和8.2時酶活力不存在顯著性差異 (P＞0.05)，所以7.2～8.2為胃淀粉酶的最適pH;胃、腸和幽門盲囊最適pH酶活力與其他各組pH酶活力存在顯著性差異 (P＜0.05)，肝的最適pH酶活力與最低酶活力pH2.2時之間存在極顯著性差異(P＜0.01)

2.3 最適溫度下駝背鱸不同消化器官消化酶活力的分布比較

如圖1－3所示，在最適溫度條件下，各消化器官蛋白酶活力順序依次為腸＞胃＞肝＞幽門盲囊;腸最適溫度酶活力顯著高于胃 (P＜0.05)，極顯著高于肝和幽門盲囊 (P＜0.01);肝和幽門盲囊不存在顯著性差異 (P＞0.05)。脂肪酶最適溫度酶活力順序為腸＞胃＞肝＞幽門盲囊，各部位之間存在顯著性差異 (P＜0.05)。最適溫度下的淀粉酶活力高低順序為腸＞幽門盲囊＞胃＞肝，腸與幽門盲囊的最適溫度淀粉酶活力不存在顯著性差異 (P＞0.05)，腸、幽門盲囊與胃之間存在顯著性差異 (P＜0.05)，胃與肝之間存在顯著性差異(P ＜0.05)。

圖6 pH對駝背鱸淀粉酶活力影響Fig.6 Effects of pH on amylase activity in C.altivelis

2.4 最適pH下駝背鱸不同消化器官消化酶活力的分布比較

圖4所示，最適pH條件下各消化器官的蛋白酶活力順序為腸＞胃＞幽門盲囊＞肝;胃與幽門盲囊的最適酶活力不存在顯著性差異 (P＞0.05);腸的最適酶活力顯著高于胃和幽門盲囊 (P＜0.05)，極顯著高于肝 (P＜0.01)。圖5所示，各部位最適pH脂肪酶活力順序為腸＞胃＞肝＞幽門盲囊，各器官之間存在顯著性差異 (P＜0.05)。圖6所示，在最適pH酶活力下的淀粉酶活力順序為腸＞幽門盲囊＞胃＞肝;腸與幽門盲囊之間不存在顯著性差異 (P＞0.05);腸和幽門盲囊與胃存在顯著性差異 (P＜0.05)，與肝存在極顯著性差異 (P＜0.01)。

3 討論

3.1 溫度與駝背鱸消化酶活力的關系

本研究在離體條件下，測定駝背鱸消化酶的最適反應溫度，在一定程度上能反映消化酶的熱穩定性和溫度對酶活力的影響規律。John［24］研究發現，魚類消化酶的最適溫度一般在30～50℃之間。黃鰭鯛胃、腸和肝在35～45℃時，3種主要消化酶都有較高活性［8］。卵形鯧鲹蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶分別在40，40和35℃達到最高值［25］。韓慶等［9］報道了洞庭鯰魚胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的最適溫度分別為40，35，35℃，腸和肝胰臟這3種主要消化酶的最適溫度均分別為45，35，30℃。本文對駝背鱸的研究結果顯示，各消化器官消化酶的最適溫度在35～45℃之間，與上述研究結果基本相同。酶與底物的反應隨著溫度的升高而加快，但超過一定溫度范圍后，酶受熱變性占主要優勢，反應速度反而隨溫度上升而減慢。本研究也表明，在20～50℃的溫度范圍內，駝背鱸消化酶的活力均隨著溫度的升高呈先升后降的趨勢，其最適反應溫度在35～45℃之間，并且高于生活的水體溫度，而魚類在最適反應溫度下其消化酶活性達到最大值，此時機體會加快對營養物質的消化吸收，從而大大提高魚類的生長速率。因此在實踐生產過程中，要以駝背鱸最適消化酶溫度為基礎，在養殖水體溫度范圍內，應隨著水溫的升高時，相應的增加投餌量，加快駝背鱸的生長速度，降低養殖成本。

3.2 pH與駝背鱸消化酶活力的關系

pH也是影響酶活力的重要因子，改變酶分子的結構和改變酶與底物的結合是pH影響酶活力的兩種主要途徑。pH過酸或過堿都會改變酶分子的結構，甚至使酶變性失活，本研究結果顯示，駝背鱸消化酶活力在設定的pH范圍內均隨著pH上升呈先升高后降低的趨勢。大眼鰤鱸 (Stizostedion vireum)胃、腸、幽門盲囊和肝胰臟蛋白酶的最適pH 分別為3.0，8.0，8.0，7.0［26］。雜色鮑胃蛋白酶最適pH為2.6～3.4［11］。卵形鯧鲹胃蛋白酶的最適pH為3.2，腸、幽門盲囊和肝的最適pH為8.0［5］。本研究結果表明，駝背鱸胃蛋白酶的最適pH為3.2，腸、幽門盲囊和肝蛋白酶均為8.2，呈弱堿性，與上述結果一致。駝背鱸胃、肝脂肪酶的最適pH分別為7.2和8.2，腸、幽門盲囊均為6.2。而黃鰭鯛［7］和洞庭鯰魚［9］的最適 pH 都為弱堿性，卵形鯧鲹［5］消化器官脂肪酶的最適pH均為6.2，呈弱酸性。本研究結果與上述研究結論相符，說明駝背鱸胃和肝脂肪酶在弱堿性條件下活力最強，而腸道和幽門盲囊脂肪酶在弱酸性條件下活力最強。目前對魚類淀粉酶最適pH的研究已有不少。姜永華等［11］研究報道，雜色鮑消化道淀粉酶的最適pH為7.2。李俊輝等［27］報道了馬氏珠母貝(Pinctada martensii)肝胰臟淀粉酶的最適pH為7.0。區又君等［5］研究表明，卵形鯧鲹胃、腸、幽門盲囊和肝淀粉酶的最適pH均呈弱堿性。本研究結果與上述結論一致。黃鰭鯛［7］的淀粉酶最適pH偏酸性，與本研究結果不同，這可能是因為淀粉酶的適宜pH因魚類種間差異而有所不同，導致生活習性和攝食對象不同而對相應的酶的性質會有所改變。

3.3 駝背鱸不同消化器官消化酶活性的分布比較

不同酶在同一器官的溫度和pH的敏感性不同，同一種酶在不同器官的溫度和pH的敏感性也不同，所以不同器官中的消化酶活力肯定有所不同，這種不同對于控制機體內復雜的代謝途徑具有重要的意義。駝背鱸蛋白酶在最適溫度和pH下的酶活力順序分別為腸＞胃＞肝＞幽門盲囊、腸＞胃＞幽門盲囊＞肝。魚類的蛋白酶分為酸性和堿性，酸性蛋白酶主要位于胃內，腸和肝內以堿性蛋白酶為主;駝背鱸的腸蛋白酶活性明顯高于胃蛋白酶，可見駝背鱸堿性蛋白酶占主要地位。Dask等［28］研究魚類消化酶的分泌機制，發現肝胰臟是分泌蛋白酶原主要場所，但其蛋白酶活力微弱或甚至沒有，并對腸道消化吸收蛋白酶起促進作用，說明了腸道的蛋白酶活力要高于肝胰臟，本實驗結果與此理論相符。駝背鱸在最適溫度和pH條件下，脂肪酶活力順序為腸＞胃＞肝＞幽門盲囊;李國希等［29］對黃鰭鯛消化酶分布的研究表明，脂肪酶活力的大小順序為腸＞胃＞肝臟。本研究結果表明，腸脂肪酶活力在兩種條件下均最大，其原因可能是氨基酸是脂肪酶的基本組成單位，而腸道是吸收營養物質的主要部位，從而說明腸道是吸收脂肪酶的重要場所。駝背鱸淀粉酶在最適溫度和pH條件下酶活力順序均為腸＞幽門盲囊＞胃＞肝，魚種類不同淀粉酶分泌的器官也不同，有的魚類肝胰臟為唯一分泌器官，有些可能有輔助分泌器官;國外學者對鯉(Cyprinus carpio)［30］的研究也表明，大多數魚類的肝臟是分泌淀粉酶原的主要場所，其淀粉酶活性卻很低。本研究也得出駝背鱸肝臟的淀粉酶活性最低，原因可能是肝臟分泌淀粉酶后，淀粉酶吸附于腸道，因而檢測到腸道的淀粉酶活性要遠高于肝臟。本研究結果與卵形鯧鲹［31］和中國龍蝦 (Panulirus stimpsoni Holthuis)［32］的結果有所差異，其主要原因還是不同種和不同食性魚之間的消化酶活力存在差異，至于其他原因尚待做進一步研究。

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