飼料中添加生長(zhǎng)激素基因重組蛋白對(duì)斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)、消化及抗氧化能力的影響*

潘忠超，石和榮，楊慧榮，王樹(shù)啟，趙會(huì)宏

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)系，廣東廣州 510642;2.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣東廣州 510630;3.汕頭大學(xué)廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東汕頭 515063）

斜帶石斑魚(yú) (Epinephelus coioides)屬鱸形目(perciformes)，鮨科 (Serranidae)，石斑魚(yú)亞科(Epinephelinae)，石斑魚(yú)屬，是我國(guó)華南沿海及東南亞地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類。由于其味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，受到廣大消費(fèi)者的青睞，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

魚(yú)類生長(zhǎng)激素 (GH)是垂體細(xì)胞分泌的一種多功能的激素，由173～188個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為20000～22000。研究表明GH參與眾多的生理調(diào)控過(guò)程，包括代謝、生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和滲透壓調(diào)節(jié)等，而且可以增加魚(yú)食欲，提高飼料轉(zhuǎn)化率［1］。目前，超過(guò)40多種魚(yú)類的GH基因已經(jīng)克隆得到［2］。從得到的氨基酸組成分析，同一目的魚(yú)類GH同源性比較高，其氨基酸組成大約有80%是相同的［3］。但是不同目的魚(yú)類GH差異較大，同源性大約只有37% ～58%，表現(xiàn)出明顯的種屬特異性［4］。將基因重組生長(zhǎng)激素通過(guò)注射［5－7］、埋植［6－8］、浸泡［6－9］、食道插管或投喂等給藥途徑［6－9］，都可以促進(jìn)魚(yú)類的生長(zhǎng)。因此，在魚(yú)類養(yǎng)殖業(yè)中采用GH來(lái)促進(jìn)魚(yú)類生長(zhǎng)是可行的。但是，這些給藥方法都需要消耗大量的人力、物力，還易引起魚(yú)的應(yīng)激反應(yīng)或造成魚(yú)體損傷，是推廣應(yīng)用GH的主要障礙。研究證實(shí)，魚(yú)類消化系統(tǒng)具有完整吸收蛋白多肽的能力［10］，GH通過(guò)投喂的方式處理魚(yú)類，能有效促進(jìn)魚(yú)體的生長(zhǎng)。目前已在金魚(yú) (Carassius auratus)［11－15］、虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)［11－15］、 黑 鱸 (Micropterus salmoides)［11－15］、牙 鲆 (Paralichthys olivaceus)［11－15］、斑 馬 魚(yú) (Daniorerio)［11－15］、 鯉 魚(yú) (Cyprinus carpio)［11－15］和尼羅羅非魚(yú) (Tilapia nilotica)［11－15］等魚(yú)類中證明了生長(zhǎng)激素具有促進(jìn)攝食和生長(zhǎng)的作用。

本試驗(yàn)研究在飼料中添加重組生長(zhǎng)激素的酵母上清液 (其中重組生長(zhǎng)激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2，4，8 mg/kg)，并與空白對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)噴涂飼料，養(yǎng)殖試驗(yàn)并測(cè)定相關(guān)生長(zhǎng)指標(biāo)、血脂、消化酶、抗氧化指標(biāo)以及組織磷酸酶的活性，探討重組生長(zhǎng)激素對(duì)斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)的影響，為斜帶石斑魚(yú)養(yǎng)殖生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)時(shí)間:2012年7－10月。

試驗(yàn)動(dòng)物及管理:斜帶石斑魚(yú)幼魚(yú)購(gòu)自廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗(yàn)中心。養(yǎng)殖試驗(yàn)在該中心進(jìn)行。試驗(yàn)魚(yú)暫養(yǎng)于500 L玻璃纖維缸中，用對(duì)照組飼料投喂2周，使其逐步適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境和膨化飼料。試驗(yàn)前挑選出體格健康、規(guī)格相近的試驗(yàn)魚(yú)，平均體質(zhì)量為 (15.15±0.51)g，平均體長(zhǎng) (8.33±0.21)cm進(jìn)行隨機(jī)分組，設(shè)對(duì)照組G0，3個(gè)處理組G1、G2、G3，每組3個(gè)重復(fù)，每缸40尾。

試驗(yàn)在室內(nèi)流水系統(tǒng)進(jìn)行，水流速度為3.2 L/min，海水鹽度27.45‰～31.26‰。試驗(yàn)期間，氣溫為 (30.38±1.22)℃，水溫為 (29.39±1.49)℃，溶解氧為 (5.96±1.38)mg/L，pH為7.43±0.22，氨氮為 (0.01±0.01)mg/L，亞硝態(tài)氮為 (0.02±0.01)mg/L，每天投喂3次，日投喂量為試驗(yàn)魚(yú)體質(zhì)量的2% ～3%，并根據(jù)天氣和攝食情況靈活調(diào)整。攝食1 h后清理糞便及殘餌，自然光照，24 h流動(dòng)海水并充氣，試驗(yàn)養(yǎng)殖周期為10周。

1.2 飼料制備

基礎(chǔ)飼料配方和營(yíng)養(yǎng)成分組成見(jiàn)表1。試驗(yàn)飼料由中山統(tǒng)一飼料有限公司制備。畢赤酵母工程菌由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所提供，生長(zhǎng)激素重組蛋白在廣州大學(xué)微生物試驗(yàn)室發(fā)酵獲得，采用噴涂技術(shù)將發(fā)酵所得上清混入飼料中。

表1 飼料基礎(chǔ)配方及營(yíng)養(yǎng)組成Table 1 The basical diet and nutrition composition

1.3 試驗(yàn)器材及試劑

剪刀，鑷子，解剖刀，注射器，紗布，試驗(yàn)盤，凱氏定氮儀 (Tecato，1030型自動(dòng)分析儀)，索氏抽提系統(tǒng) (Tecato，Soxtec system HT6)，烘箱(MBE，GZC－9246)，天平 (JA1003N)，水浴鍋(上海一恒，DK.8D)，酶標(biāo)儀 (Thermo，MULTISKAN MK3)，分光光度計(jì) (MC，UV759S)等。

1.4 樣品處理

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，將試驗(yàn)魚(yú)饑餓24 h。稱取每缸魚(yú)的總質(zhì)量并統(tǒng)計(jì)數(shù)量。每缸隨機(jī)選取10尾魚(yú)，取5尾魚(yú)作全魚(yú)體成分分析，剩余5尾魚(yú)用于生化分析采樣。首先采血，將血液低溫離心 (4℃，3000 r/min，15min)分離血清，低溫保存(－40℃)備用。肝臟、肌肉、腸道等組織，稱量后加入9倍的生理鹽水，研磨均勻，將研磨液低溫離心 (4℃，3000 r/min，15 min)，取其上清液低溫保存 (－80℃)備用。記錄每尾魚(yú)體質(zhì)量、體長(zhǎng)以及解剖后的內(nèi)臟、肝臟、肌肉和腸系膜脂肪的質(zhì)量，并收集肌肉以測(cè)定其粗蛋白和粗脂肪。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定 記錄各組魚(yú)的采食量，分別在試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)獲取魚(yú)體質(zhì)量、肌肉、肝胰臟和腸系膜脂肪質(zhì)量數(shù)據(jù)。

初均質(zhì)量 (W0)、末均質(zhì)量 (Wt)、均攝食量(g)、增質(zhì)量率 (WGR)、體長(zhǎng)增長(zhǎng)率 (LGR)、特定生長(zhǎng)率 (SGR)、飼料系數(shù) (FC)、成活率(%)、肥滿度 (CF)、臟體比 (%)、肝體比(%)和脂體比 (%)的計(jì)算公式如下:

初均質(zhì)量 (W0)=初總質(zhì)量/魚(yú)尾數(shù);末均質(zhì)量 (Wt)=末總質(zhì)量/魚(yú)尾數(shù);

均攝食量 (g)=攝食總量/魚(yú)尾數(shù);肥滿度(CF)=體質(zhì)量 (g)/體長(zhǎng) (cm)3;

臟體比=內(nèi)臟的質(zhì)量/魚(yú)的體質(zhì)量;肝體比=肝的質(zhì)量/魚(yú)的體質(zhì)量;

脂體比=腸系膜脂肪質(zhì)量/魚(yú)的體質(zhì)量;

其中 Lt、Wt、Nt和 L0、W0、N0分別為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)和放養(yǎng)魚(yú)時(shí)的平均體長(zhǎng)、平均體質(zhì)量、數(shù)量;G為攝餌的總量;T為試驗(yàn)總天數(shù)。

1.5.2 樣品分析 飼料、全魚(yú)和肌肉的粗蛋白測(cè)定采用凱氏微量定氮法 (GB6432－86);粗脂肪采用索氏抽提法測(cè)定 (GB/T5009.6－2003);粗灰分采用燒灼法 (GB6438－86);水分的測(cè)定采用105℃恒溫烘干失重法 (GB6435－86);血脂含量采用高效液相法檢測(cè)。

采用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白含量，淀粉酶(AMS)、脂肪酶 (LPS)、胰蛋白酶、超氧化物歧化酶 (SOD)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛 (MDA)、堿性磷酸酶 (AKP)和酸性磷酸酶 (ACP)的測(cè)定方法均由南京建成生物工程研究所的測(cè)試盒提供。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用Excel電子表格記錄，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±SE)的形式表示，采用單因素方差分析，顯著水平為p＜0.05。當(dāng)差異顯著時(shí)采用Duncan's多重比較分析組間的差異顯著程度。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 基因重組生長(zhǎng)激素對(duì)斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，斜帶石斑魚(yú)的各項(xiàng)生長(zhǎng)性能指標(biāo)見(jiàn)表2。由表2可知，試驗(yàn)組斜帶石斑魚(yú)的末均質(zhì)量、增質(zhì)量率、攝食量、體長(zhǎng)增長(zhǎng)率以及特定生長(zhǎng)率均高于對(duì)照組，其中G2組斜帶石斑魚(yú)末均質(zhì)量最高，達(dá)到57.23 g，高出對(duì)照組9.97%(p＜0.05)，增質(zhì)量率達(dá)到293.16%，高出對(duì)照組23.75%(p＜0.05);G2組斜帶石斑魚(yú)的攝食量最多，且高于其它試驗(yàn)組，高出對(duì)照組9.99%(p＜0.05);體長(zhǎng)增長(zhǎng)率趨勢(shì)與攝食量一致，G2組最高，顯著高于對(duì)照組 (p＜0.05);G2組的特定生長(zhǎng)率最高，但4組之間無(wú)顯著差異;飼料系數(shù)方面，3個(gè)試驗(yàn)組較對(duì)照組均低，G2組最低，但4組之間無(wú)顯著差異。

表2 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)、攝食、飼料系數(shù)和成活率的影響1)Table 2 Effects of r-gGH on the growth，feeding，feeding rate and survival rate of Epinephelus coioides

2.2 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)形態(tài)學(xué)和體成分的影響

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，斜帶石斑魚(yú)的形態(tài)學(xué)指標(biāo)和魚(yú)體成分分析，見(jiàn)表3和表4。形態(tài)學(xué)方面，飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)的形態(tài)學(xué)指標(biāo)均沒(méi)有顯著影響 (p＞0.05);G3組斜帶石斑魚(yú)肥滿度較對(duì)照組高出4.7%;G1及G3組斜帶石斑魚(yú)臟體比與G0組比較均下降;試驗(yàn)組斜帶石斑魚(yú)脂體比與對(duì)照組相比有一定程度的下降，其中G1組最低，比G0組下降17.24%。

魚(yú)體成分分析表明，G2組全魚(yú)粗蛋白含量最高，顯著高于G0組 (p＜0.05)。G2組魚(yú)體肌肉中粗脂肪的含量低于其它試驗(yàn)組，并且顯著低于G0組 (p＜0.05)。

表3 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響Table 3 Effects of r-gGH on morphology of Epinephelus coioides

表4 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)體成分的影響1)Table 4 Effects of r-gGH on body composition of Epinephelus coioides

2.3 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)血脂的影響

如表5所示，G1、G2、G3組斜帶石斑魚(yú)的膽固醇 (CHOL)、低密度脂蛋白 (LDL)和甘油三酯 (TG)含量均低于對(duì)照組，且G1和G2組的低密度脂蛋白 (LDL)含量顯著低于G0組 (p＜0.05)，試驗(yàn)組魚(yú)的高密度脂蛋白含量均高于對(duì)照組，其中G2組最高，高出G0組80%。

表5 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)血脂的影響1)Table 5 Effects of r-gGH on blood fat of Epinephelus coioides

2.4 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)消化酶活性的影響

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取斜帶石斑魚(yú)的腸道檢測(cè)消化酶的活性，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。在斜帶石斑魚(yú)的腸道中3種消化酶均有表達(dá)，其中胰蛋白酶活性最高;試驗(yàn)組魚(yú)的淀粉酶活性均高于對(duì)照組，G2組最高，并且顯著高于G0組 (p＜0.05);試驗(yàn)組魚(yú)脂肪酶活性均顯著高于對(duì)照組 (p＜0.05)。

表6 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)消化酶活性的影響1)Table 6 Effects of r-gGH on digestive enzymes of Epinephelus coioides

2.5 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)體組織抗氧化指標(biāo)的影響

試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)肌肉進(jìn)行丙二醛 (MDA)含量測(cè)定，抗氧化指標(biāo)均用肝臟組織檢測(cè)。如表7所示，試驗(yàn)組斜帶石斑魚(yú)的MDA水平均低于對(duì)照組，并隨著濃度的增加而降低，G3組最低并且顯著低于G0組 (p＜0.05);過(guò)氧化氫酶 (CAT)活性與MDA的趨勢(shì)相反，試驗(yàn)組斜帶石斑魚(yú)的CAT活性均高于對(duì)照組，并隨著濃度的增加而升高，G3組最高且顯著高于G0組 (p＜0.05);試驗(yàn)組魚(yú)的總抗氧化能力高于對(duì)照組，G2組魚(yú)的的總抗氧化能力顯著高于G0組 (p＜0.05)，飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)的SOD活性影響不大。

表7 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)體組織抗氧化指標(biāo)的影響1)Table 7 Effects of r-gGH on antioxidant indexes of Epinephelus coioides tissue

2.6 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)組織磷酸酶活性的影響

試驗(yàn)結(jié)束后，檢測(cè)肝臟和血液的磷酸酶活性。如表8所示，G2組魚(yú)肝臟堿性磷酸酶 (AKP)和酸性磷酸酶 (ACP)的活性最高而且顯著高于對(duì)照組 (p＜0.05);血液中G2組魚(yú)的磷酸酶活性也是最高的，但各組之間無(wú)顯著性差異。

表8 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)組織磷酸酶活性的影響1)Table 8 Effects of r-gGH on phosphates activities of Epinephelus coioides tissue

3 討論

魚(yú)類重組GH的基本功能是促生長(zhǎng)，研究報(bào)道較為全面。在轉(zhuǎn)基因魚(yú)類中研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)生長(zhǎng)激素基因的銀大馬哈魚(yú) (Oncorhynchus kisutch)生長(zhǎng)速度顯著提高，其血漿中GH的水平明顯高于非轉(zhuǎn)基因魚(yú)［16］。然而，隨著生物安全性越來(lái)越被重視，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的質(zhì)疑聲也越來(lái)越多，其安全問(wèn)題有待驗(yàn)證。研究表明［17］，外源生長(zhǎng)激素的半衰期一般在6 h以內(nèi)，在12～24 h之后，基本檢測(cè)不到。美國(guó)食品和藥物管理局 (FDA)公布了30年來(lái)對(duì)牛生長(zhǎng)激素的研究結(jié)果，從多方面證實(shí)了使用牛生長(zhǎng)激素的安全性［18］。目前，北美和歐洲許多國(guó)家已批準(zhǔn)牛生長(zhǎng)激素在乳牛養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用［19］。從理論上講，魚(yú)類生長(zhǎng)激素是一種蛋白激素，對(duì)熱不穩(wěn)定，蒸煮時(shí)會(huì)分解為氨基酸而失去激素的生理功能活性，食用后對(duì)人畜無(wú)害。人的生長(zhǎng)激素能促進(jìn)魚(yú)的生長(zhǎng)，但對(duì)魚(yú)生長(zhǎng)激素受體的結(jié)合活性要比魚(yú)類自身生長(zhǎng)激素低150倍，而魚(yú)類生長(zhǎng)激素對(duì)哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)激素受體無(wú)任何結(jié)合活性［18－19］。因此，從不同的角度分析和實(shí)驗(yàn)證實(shí)，作為餌料添加劑的魚(yú)類生長(zhǎng)激素是安全的。

3.1 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼料中添加4 mg/kg的重組生長(zhǎng)激素蛋白能顯著提高斜帶石斑魚(yú)的生長(zhǎng)性能。前人通過(guò)不同的方法證明重組GH能夠促進(jìn)魚(yú)類的生長(zhǎng)，例如用重組GH通過(guò)腹腔注射，口服，浸泡等方式處理魚(yú)類，都能顯著提高魚(yú)類的生長(zhǎng)速度［6－7，19］，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相同。本研究以 4 mg/kg的劑量重組生長(zhǎng)激素上清為餌料添加劑時(shí)，斜帶石斑魚(yú)的增質(zhì)量率與體長(zhǎng)增長(zhǎng)率與對(duì)照組相比較有顯著性差異。而較高 (8 mg/kg)或者較低質(zhì)量分?jǐn)?shù) (2 mg/kg)也能促進(jìn)魚(yú)類的生長(zhǎng)，但不如4 mg/kg組明顯，這可能是因?yàn)橹亟MGH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)太低，不足以引起魚(yú)類較大的生理反應(yīng)，太高可能引起GH下游相關(guān)因子的負(fù)反饋調(diào)節(jié)所致。現(xiàn)有的研究表明，魚(yú)類內(nèi)分泌調(diào)控GH—IGF-Ⅰ軸是魚(yú)類生長(zhǎng)發(fā)育的重要調(diào)控軸，外源化學(xué)物質(zhì)可能直接作用于該軸，影響下游IGF-Ⅰ等因子的表達(dá)，從而影響魚(yú)類的生長(zhǎng)發(fā)育［17］。

Acosta等［21］首先研究了重組 GH在金魚(yú)中的促攝食作用，向飽食的金魚(yú)腹腔注射重組GH(0.2 μg)2 h后食量顯著增加。同時(shí)向金魚(yú)腹腔注射重組GH及其受體拮抗物后發(fā)現(xiàn)重組GH的促攝食作用受到抑制。隨后Zhang等［22］的研究也表明重組GH具有促進(jìn)金魚(yú)攝食的作用。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)的攝食量有提高作用，且以4 mg/kg效果最佳。

本試驗(yàn)表明，添加4 mg/kg重組斜帶石斑魚(yú)GH的飼料，斜帶石斑魚(yú)幼魚(yú)的餌料轉(zhuǎn)化效率有所提高，餌料系數(shù)從對(duì)照組的1.21降低到1.14。由此推斷，重組GH的促生長(zhǎng)效應(yīng)一部分是通過(guò)提高餌料轉(zhuǎn)化效率來(lái)實(shí)現(xiàn)的。此結(jié)果在其它魚(yú)上也得到證實(shí)。Liu等［23］發(fā)現(xiàn)，用牙鲆GH的轉(zhuǎn)基因集胞藻(Synechocystis)投喂牙鲆，其生長(zhǎng)速度顯著提高，且餌料系數(shù)從2.0降低到1.2;Liu等［23］的研究結(jié)果也表明，用牙鲆GH的轉(zhuǎn)基因小球藻投喂牙鲆，除了生長(zhǎng)速度顯著提高外，其餌料轉(zhuǎn)化效率也從對(duì)照組的0.53升高到高劑量組的0.72。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，餌料系數(shù)的降低意味著養(yǎng)殖成本的降低，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)會(huì)帶來(lái)較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，使養(yǎng)殖戶在市場(chǎng)中更有競(jìng)爭(zhēng)力。此外，餌料轉(zhuǎn)化效率的提高意味著合成代謝的增加和分解代謝的減少，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的改善也有很大幫助，尤其是在高密度養(yǎng)殖環(huán)境下可以減少水產(chǎn)病害的發(fā)生。

3.2 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)形態(tài)學(xué)和體成分的影響

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中添加生長(zhǎng)激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 mg/kg時(shí)，全魚(yú)粗蛋白含量顯著提高，且肌肉脂肪含量顯著降低。此結(jié)果和Li等［24］的結(jié)果不盡相同。王常安等［25］發(fā)現(xiàn)，用含有鮭魚(yú) (Oncorhynchus keta)GH的酵母投喂牙鲆，其肌肉中的總蛋白和總脂肪都有明顯的上升。盡管影響魚(yú)體組成的因素有很多種，但是我們推測(cè)，上述研究結(jié)果不一致的原因很有可能是研究中基礎(chǔ)餌料的不一致以及魚(yú)自身代謝具有種屬特異性。

3.3 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)生化指標(biāo)的影響

魚(yú)類血液與機(jī)體的代謝、營(yíng)養(yǎng)狀況及疾病有著密切的關(guān)系，當(dāng)魚(yú)體受到外界因子的影響而發(fā)生生理或病理變化時(shí)，必定會(huì)在血液指標(biāo)中反映出來(lái)。因此，血液成分的變化被廣泛地用來(lái)評(píng)價(jià)魚(yú)類的健康狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)狀況，也是重要的生理、病理和毒理學(xué)指標(biāo)［20］。魚(yú)的血脂含量受營(yíng)養(yǎng)狀況、季節(jié)、運(yùn)動(dòng)狀況和咸淡水等多種因素影響，一般在咸水中飼養(yǎng)的魚(yú)類比在淡水中飼養(yǎng)的魚(yú)類血脂含量低［28］。另外，攝食情況、生長(zhǎng)和身體狀況也是影響蛋白含量的重要因素。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組的膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯均低于對(duì)照組，且2 mg/kg和4 mg/kg試驗(yàn)組的低密度脂蛋白顯著低于對(duì)照組 (p＜0.05)，說(shuō)明飼料中添加生長(zhǎng)激素基因重組蛋白能顯著降低斜帶石斑魚(yú)的血脂水平，這與王常安等［25］研究結(jié)果一致，說(shuō)明外源生長(zhǎng)激素可以調(diào)控斜帶石斑魚(yú)的生理代謝;試驗(yàn)組的高密度脂蛋白均高于對(duì)照組，且4 mg/kg試驗(yàn)組最高，高出對(duì)照組80%。這可能是由于添加的重組蛋白影響了下游相關(guān)酶的代謝，從而促進(jìn)了脂肪的利用和高密度脂蛋白的合成。總之，在飼料中添加斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)激素基因重組蛋白降低了其血脂水平，更加有利于市場(chǎng)推廣。

3.4 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)消化酶活性的影響

消化酶主要指由消化腺和消化系統(tǒng)分泌的具有營(yíng)養(yǎng)消化作用的酶類，魚(yú)類的消化酶主要分為:蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶。魚(yú)類對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化能力取決于消化酶的活力，消化酶活性是反映魚(yú)類消化機(jī)能的重要指標(biāo)，其高低直接關(guān)系到魚(yú)類對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，影響斜帶石斑魚(yú)消化酶活性的因素較多，如營(yíng)養(yǎng)、鹽度、溫度、生長(zhǎng)、年齡等［27，29］，在本試驗(yàn)中，主要考慮生長(zhǎng)激素基因重組蛋白對(duì)斜帶石斑魚(yú)消化酶活性的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，肝臟的胰蛋白酶活性在所有消化酶活性中是最高的，可見(jiàn)胰蛋白酶是斜帶石斑魚(yú)主要的消化酶，同時(shí)也是蛋白質(zhì)最重要的消化酶。試驗(yàn)組脂肪酶和淀粉酶的活力均高于對(duì)照組，說(shuō)明重組GH能夠促進(jìn)斜帶石斑魚(yú)對(duì)飼料淀粉和脂肪的消化，這與林建斌等［29］的報(bào)道一致，雖然魚(yú)類消化酶的研究取得了很多成果，但在其研究過(guò)程中還有很多問(wèn)題和不足，魚(yú)類消化酶的進(jìn)一步研究，將越來(lái)越受到人們的重視。

3.5 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)組織抗氧化指標(biāo)的影響

魚(yú)類自身存在特定的抗氧化防御機(jī)制以應(yīng)對(duì)氧化壓力，它能消除體內(nèi)自由基，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞防御能力和機(jī)體免疫功能，維持細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡。魚(yú)類在進(jìn)行生理活動(dòng)的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生氧自由基，如分解氧以提供能量的電子傳遞鏈過(guò)程、吞噬細(xì)胞的吞噬過(guò)程以及外源物質(zhì)的分解過(guò)程等［30］。抗氧化系統(tǒng)主要由抗氧化酶和非酶類復(fù)合物構(gòu)成。其中，超氧化物歧化酶 (SOD)、過(guò)氧化氫酶 (CAT)等是構(gòu)成抗氧化酶系統(tǒng)的主要成分，在清除活性氧自由基中起著決定作用［31］。MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中衍生的代謝產(chǎn)物，同時(shí)MDA也是不飽和脂肪酸過(guò)氧化終產(chǎn)物之一，被作為一種細(xì)胞膜氧化損傷的指示物［33］它的高低也間接反映了機(jī)體細(xì)胞受損的程度。正常情況下，氧自由基的產(chǎn)生和清除過(guò)程處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但當(dāng)受到饑餓、擁擠、溫度和鹽度等外界因素的刺激時(shí)，魚(yú)體內(nèi)的自由基水平會(huì)超過(guò)機(jī)體清除能力，就會(huì)產(chǎn)生氧化壓力，嚴(yán)重時(shí)會(huì)對(duì)魚(yú)體造成氧化損傷［32］魚(yú)類具有清除自身自基及氧化中間產(chǎn)物的抗氧化防御機(jī)制，其中抗氧化系統(tǒng)對(duì)氧化脅迫的清除起著決定性作用。

本試驗(yàn)中MDA的活性隨著重組GH的添加質(zhì)量濃度增加而降低，說(shuō)明外源的生長(zhǎng)激素重組蛋白對(duì)斜帶石斑魚(yú)的細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。這與Zaccaron［33］的研究相一致。SOD是一種特異性消除超氧自由基的循環(huán)酶，主要負(fù)責(zé)過(guò)氧化和噬菌作用造成的組織損傷的防御保護(hù)作用。SOD含量越高，說(shuō)明有待清除的超氧自由基越多［36］。本試驗(yàn)SOD的變化并不顯著，說(shuō)明基因重組蛋白造成的機(jī)體細(xì)胞損傷能及時(shí)的清除。過(guò)氧化氫酶 (CAT)催化H2O2分解為H2O，保護(hù)機(jī)體穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞的正常生活。本實(shí)驗(yàn)中過(guò)氧化氫酶的活性隨著添加濃度的增加而升高，說(shuō)明添加基因重組生長(zhǎng)激素蛋白對(duì)于斜帶石斑魚(yú)的抗氧化性有一定的提高。這可能是由于本次體外表達(dá)的載體是畢赤酵母，有關(guān)研究表明［34］，酵母表達(dá)產(chǎn)物有利于增加機(jī)體的抗氧化能力。本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，試驗(yàn)組斜帶石斑魚(yú)的總抗氧化能力均高于對(duì)照組，且4mg/kg試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明體外噴涂斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)激素基因重組蛋白可以增強(qiáng)其抗氧化能力，這可能是由于重組GH在促進(jìn)生長(zhǎng)的同時(shí)，又增強(qiáng)了機(jī)體的免疫力。

3.6 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚(yú)組織磷酸酶活性的影響

ACP和AKP是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，在體內(nèi)直接參與磷酸集團(tuán)的轉(zhuǎn)移與代謝，是參與動(dòng)物體內(nèi)免疫活動(dòng)重要的水解酶類［35］。本研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加一定量的重組生長(zhǎng)激素能明顯的提高斜帶石斑魚(yú)肝臟磷酸酶的活性，且當(dāng)添加量為4 mg/kg的重組生長(zhǎng)激素時(shí)，斜帶石斑魚(yú)的肝臟和血液表現(xiàn)出的磷酸酶活性最高。GH作為一種促生長(zhǎng)激素，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都已證實(shí)GH能夠影響水生動(dòng)物的免疫功能［1］，適量的補(bǔ)充外源的GH能夠提高水生生物的體液免疫因子。李晶等［6］研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)投喂含有重組GH的飼料能顯著提高鮭魚(yú)體內(nèi)的ACP和AKP的活性，黃新春等［12］研究表明，適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充GH能顯著提高異育銀鯽血清中AKP的活性。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在飼料中添加4 mg/kg的生長(zhǎng)激素基因重組蛋白對(duì)于斜帶石斑魚(yú)的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用且能提高飼料利用率。重組GH產(chǎn)生這種促生長(zhǎng)效果的同時(shí)增加了魚(yú)體粗蛋白的含量，減少了粗脂肪的含量，對(duì)于其它形態(tài)學(xué)指標(biāo)影響不大，且沒(méi)有致死或者致畸的現(xiàn)象發(fā)生。另外重組GH的添加不僅降低了斜帶石斑魚(yú)的血脂水平，改善了其消化能力和抗氧化能力，提高了體液免疫因子的活性，對(duì)于當(dāng)今大眾對(duì)低脂肪，高蛋白食物的需求有重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此我們認(rèn)為含有斜帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)激素的酵母上清是一種綠色環(huán)保，且效果顯著的餌料添加劑，值得大規(guī)模的推廣和應(yīng)用。

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