利用母本來源的單倍體技術獲得雙抗TMV和PVY煙草株系

劉勇，陳學軍，肖炳光，李永平

云南省煙草農業科學研究院,云南昆明圓通街33號 650021

利用母本來源的單倍體技術獲得雙抗TMV和PVY煙草株系

劉勇，陳學軍，肖炳光，李永平

云南省煙草農業科學研究院,云南昆明圓通街33號 650021

為選育雙抗煙草花葉病毒（TMV）和馬鈴薯Y病毒（PVY）的煙草材料,采用Coker176與NC55雜交后代F1與非洲煙雜交獲得單倍體苗,經過苗期抗性鑒定、分子標記輔助選擇和葉脈培養加倍,獲得母本來源的雙抗TMV和PVY的雙單倍體。通過人工接種抗性鑒定、標記檢測和田間株系比較,獲得抗性、植物學性狀穩定的雙單倍體第三代種子。與常規雜交系統選育相比較,雙單倍體方法的獲得后代變異更大、性狀更容易穩定。

非洲煙；單倍體；TMV；PVY；育種

煙草常規雜交育種由于性狀分離,需要經過4～5代的連續選擇,才能獲得性狀穩定的品系。理論上,加倍單倍體的純合只需要1個世代, 就能獲得性狀穩定株系。因此,采用單倍體育種技術,可明顯縮短育種年限[1]。煙草單倍體誘導有來源于雄配子和雌配子2條途徑,誘導來源于雄配子的單倍體的常用方法為花藥培養,具有步驟簡便,單倍體苗易獲得等優點[2]。采用花粉離體培養或者游離小孢子培養獲得雄核發育的單倍體也有報道[2]。但利用雄配子來源的單倍體育成的煙草品種存在產量降低等劣勢,美國等煙草育種先進國家,并不采用雄配子來源的單倍體用于育種[3]。我國只有單育一號等幾個煙草品種曾在生產上推廣利用[4]。來源于雌配子的煙草單倍體育成的品種,無產量降低的劣勢[5]。采用未授粉子房、胚株離體培養可誘導來源于雌配子的單倍體植株[6],但步驟復雜,難以滿足育種的需求。利用遠源雜交產生母本來源的單倍體,在玉米育種中應用廣泛[7]。利用煙草野生種非洲煙（Nicotiana african）和烤煙雜交,產生母本來源的單倍體在美國育種應用廣泛[8-9]。美國著名的烤煙品種NC71等,在選育過程中采用了母本來源的雙單倍體技術。煙草單倍體加倍常用秋水仙堿處理生長點,存在加倍效率較低的問題[10]。葉脈組織培養加倍煙草單倍體,在美國應用較早?？纤髮W的M.J.Kasperbauer等（1972）研究發現,利用葉片中脈組織培養方法[11],可以獲得加倍單倍體植株,隨著篩選方法的提高,目前國外同行的單倍體葉脈培養加倍率已達到80%左右。

煙草馬鈴薯 Y病毒?。≒VY)和煙草花葉?。═MV）是危害煙草的重要病毒病害,通?；旌习l生[12]。煙草種質資源中,已鑒定出攜帶抗PVY基因va的煙草種質NC55[13]和攜帶抗TMV基因N的煙草種質Coker176[14]。但缺乏雙抗PVY和TMV的煙草抗源。本文采用組合F1與非洲煙雜交產生母本來源的單倍體,苗期接種篩選抗病株,利用葉脈組織培養加倍等技術,獲得雙抗TMV和PVY的煙草育種中間材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

煙 草 種 質 Coker176（ 抗 TMV）、 NC55（ 抗PVY）和非洲煙（N.african）由本院提供。TMV和PVY毒源分別在防蟲網室內繁殖保存。

1.2 雜交組合配制

利用常規方法配制Coker176和NC55的F1雜交組合。F1在塑料大棚內移栽,開花時,人工去雄,取非洲煙的花粉授粉。授粉后套袋,單株收種得到種子（F1-Naf）。去雄、授粉和收種要仔細操作,防止污染。

1.3 單倍體苗挑選與抗性鑒定

在塑料盤或育苗盤上密集播種F1-Naf。煙苗2片真葉時,用牙簽標記類似單倍體的單株。煙苗4-5片真葉時,再次挑選類似單倍體的煙苗盆栽,成活后,混合接種TMV病葉汁液1000倍和PVY病葉汁液100倍。定期調查病害癥狀。篩選抗病的苗,淘汰感病苗。同時采用N基因[15]和Va基因的分子標記[16],檢測驗證類似單倍體苗的抗性。

1.4 葉脈組織培養加倍

開花時根據花的形態和是否結實,在抗病單株中挑選單倍體植株的中部葉片,取中脈組織培養。方法為：取主脈約鉛筆粗細的中部葉片,剪取葉基部約5 cm長主脈,用自來水沖洗干凈。用75﹪乙醇消毒1 min,無菌水沖洗2次,再用0.1﹪升汞消毒10 min,無菌水沖洗5～6次,將主脈切成小段。接種到MS+2.0 mg/L KT +0.2 mg/L NAA的培養基上誘芽,待芽長到2 cm高時,接種到1/2 MS培養基+IBA 0.5 mg/L中誘根培養,煙苗3 cm高時,假植至漂浮盤中,成活后盆栽或移栽大田。開花后選取可育單株套袋留種。對來源于同一個單倍體的加倍單株混合收種（DH1）。

1.5 加倍單株抗性鑒定與農藝性狀觀察

對雙單倍體第1代材料(DH1),每份盆栽60株左右,苗期人工混合接種TMV和PVY,方法同上。調查發病情況,驗證抗性是否穩定。對雙單倍體第1代和第2代材料（DH2）進行株系比較試驗,方法為大田雙行區移栽60株,初步觀察植物學性狀和農藝性狀,挑選表現較好的單株留種。

2 結果與分析

2.1 雙抗TMV與PVY單倍體單株的獲得與加倍

在Coker176（抗TMV）與NC55（抗PVY）的雜交的F1植株上,用非洲煙花粉授粉,2009年8月獲得雜交種子（F1-Naf）。2009年9月播種,挑選出類似單倍體的煙苗約20株。苗期混合接種TMV/PVY,根據接種后第5 d至開花期的病害調查結果,篩選出3株雙抗的單倍體和1株單抗TMV的單倍體（表1）。與PVY抗性相關的Va標記和與TMV抗性相關的N基因標記檢測結果表明（表1）,3個雙抗單株攜帶分別來源于雙親的va位點和N基因。通過葉脈組織培養加倍,2010年底獲得雙單倍體種子（雙單倍體第1代株系（DH1））。

表1 單倍體苗抗性鑒定與標記檢測Tab.1 Haploid seedlings resistance identification and marker detection

2.2 雙單倍體第1代株系抗性鑒定與性狀觀察

2011年防蟲溫室內,每個雙單倍體株系盆栽60株的苗期抗性鑒定結果表明：接種后5 d,3個株系的單株全部表現TMV枯斑；接種后21 d調查,V8-N2和V9-N2的PVY發病率為0,V9-N1的PVY發病率為6.35%（表2）。表明3個雙單倍體第1代株系的對TMV和PVY的抗性穩定。大田株系比較試驗表明,雙單倍體株系間的植物學性狀和農藝性狀出現較明顯的分離（表3）。V8-N2株系的葉片數少,葉片窄；V9-N1和V9-N2株系現蕾期的株高、葉型出現明顯的寬葉與窄葉分離,挑選株型較好的單株留種,獲得雙倍體第2代（DH2）種子。

表2 雙單倍體第1代株系抗性鑒定Tab.2 Resistance identification of first generation double-haploid lines

表3 雙單倍體第1代株系的植物學與農藝性狀Tab.3 The botanical and agronomic traits of first generation double-haploid lines

2.3 雙單倍體第2代株系比較

2012年大田株系比較試驗表明,雙單倍體第2代株系的植物學性狀和農藝性狀出現趨于穩定（表4）。其中V9N2-12和V9N2-13與對照品種NC55的畝產量相當,在這兩個株系中挑選株型較好的單株留種,獲得雙倍體第3代（DH3）種子。

表4 雙單倍體第2代株系的植物學與農藝性狀Tab.4 The botanical and agronomic traits of second generation double-haploid lines

2.4 雙單倍體抗病育種的特點

以聚合TMV抗性（Coker 176的N基因）和NC55的PVY抗性（va位點）為例,雙單倍體方法和常規雜交方法的程序差異較大（表5）。采用冬季加代,從F1種子開始至獲得雙抗且抗性純合的種子,兩種方法均需要18個月左右時間。雙單倍體方法的工作量主要為配制F1與非洲煙雜交的種子、單倍體苗獲得和單倍體加倍,技術難點為單倍體苗獲得和加倍。常規雜交方法的工作量主要為F2抗病單株篩選和F3測交。雙單倍體株系的抗性和農藝性狀相對穩定,獲得性狀穩定的品系預計可比常規雜交方法縮短1～2年。雙單倍體株系之間的葉片數和葉片大小等性狀的變異較大。

表5 雙單倍體與常規育種的程序比較Tab.5 Comparison between double-haploid disease-resistance breeding methods and conventional disease-resistance breeding methods

3 結論與討論

雙單倍體方法在聚合兩種或多種抗性方面,具有后代目標性狀容易穩定的優點,但同時存在技術較為復雜,獲得單倍體和單倍體加倍的難度較大的問題,可通過增加F1與非洲煙的雜交種子數量及采用流式細胞儀輔助篩選單倍體的方法加以解決。本文采用葉脈培養加倍方法,該方法具有加倍效率較高的優點,但從葉脈培養至獲得種子,需要12個月左右的時間。通過采用苗期鑒定單倍體苗,秋水仙堿處理腋芽[17]等加倍方法,預計可縮短加倍時間7個月左右。

致謝：感謝楊華兵和楊彥明在溫室管理和組織培養中的幫助。

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Tobacco lines resistant to TMV and PVY obtained by maternal-derived haploid breeding methods

LIU Yong,CHEN Xuejun,XIAO Bingguang,LI Yongping
Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Science, Kunming 650021, China

Doubled haploid (DH) technique can accelerate traits stabilization in hybridization offspring.In the breeding of variety resistant to Tobacco mosaic virus (TMV) and Potato virus Y (PVY), haploids were obtained from F1hybrids between Coker176 and NC55 crossing as female toNicotiana african.TMV and PVY resistant haploids were selected by seedling resistance identification and molecular marker test.DH plants were regenerated from leaf mid-vein culture method.Artificial inoculated resistance evaluation, markers detection, and field comparison were conducted.The third generation seed of DH lines which showed stable resistance and botanical characters were harvested.Compared to conventional hybrid breeding methods, DH breeding method showed greater variation between offspring lines and objective traits were relatively more stable.

Nicotiana african;haploid; breeding

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.03.014

S435.72 文獻標志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）03-0084-05

中國煙草總公司云南省公司科技項目（2010YN01,2012YN02）;云南省社會發展科技計劃（2010CD127）

劉勇（1970—）,博士,副研究員,主要從事煙草病害防治與抗病育種研究,Tel：0871-65106352,Email: yliu@yntsti.com

李永平（1967—）,碩士,研究員,主要從事煙草育種研究,Email: liyongping@yntsti.com

2013-06-03