施用腐熟秸稈肥對烤煙成熟期碳代謝途徑影響的初報

賈宏昉，陳紅麗，黃化剛，楊永霞，崔紅，劉國順

1河南農業大學煙草學院、國家煙草栽培生理生化基地，河南省鄭州市文化路95號 450002；2 貴州省煙草公司畢節市公司，貴州省畢節市天河路116號 551700

施用腐熟秸稈肥對烤煙成熟期碳代謝途徑影響的初報

賈宏昉1，陳紅麗1，黃化剛2，楊永霞1，崔紅1，劉國順1

1河南農業大學煙草學院、國家煙草栽培生理生化基地，河南省鄭州市文化路95號 450002；2 貴州省煙草公司畢節市公司，貴州省畢節市天河路116號 551700

為了探明土壤添加腐熟秸稈對成熟期烤煙中部煙葉淀粉代謝途徑的影響，明確獲取優質煙葉的最佳施用量。本試驗以烤煙品種NC89為試材，設置添加腐熟秸稈0 g/盆、80 g/盆和160 g/盆3個處理，研究不同量腐熟秸稈對成熟期烤煙淀粉積累、碳代謝相關酶活及關鍵基因表達的影響。結果表明：在烤煙發育成熟期，土壤添加不同量腐熟秸稈對中部葉還原糖、總糖及淀粉含量影響顯著。土壤添加腐熟秸稈均可提高淀粉酶的活性，但是對轉化酶影響不大；對碳代謝關鍵基因的表達分析表明添加腐熟秸稈增加了蔗糖合成酶基因（SS）、蔗糖轉運蛋白基因（SUT1）、焦磷酸化酶基因（AGPase）和顆粒結合型淀粉合成酶基因（GBSSI）等關鍵基因的表達，從而促進成熟期煙葉碳代謝途徑的進行，有利于提高煙葉的品質；其中每盆添加80 g腐熟秸稈取得的效果最好。

煙草；腐熟秸稈；碳代謝；成熟期

土壤的營養狀態是影響植物生長發育的重要因子，對烤煙葉片淀粉的積累有顯著影響。烤煙的品質與淀粉含量密切相關，煙草中淀粉的分解、轉化、消耗和積累決定著煙葉內在品質和外觀商品等級的優劣[1-2]。我國煙葉中淀粉含量約為4%～6%，遠遠高于國外優質烤煙的淀粉含量（1%～2%）[3]。淀粉含量高已經成為制約我國煙葉質量提高的一個重要因素。碳代謝途徑是淀粉積累分解的重要環節，探討烤煙淀粉積累及其組分的變化機理對改善烤煙品質具有重要價值。淀粉是碳代謝途徑產物的重要形式，烤煙葉片中的碳代謝產物主要分為總糖、還原糖和淀粉，這三種物質的含量對烤煙品質的影響很大。與碳代謝密切相關的基因有蔗糖合成酶基因（SS）、蔗糖轉運蛋白基因（SUT1）、蔗糖轉化酶基因（INV）、焦磷酸化酶基因（AGPase）和顆粒結合型淀粉合成酶基因（GBSSI）等[4-6]。前人在水稻、小麥、大豆等作物上研究表明，葉片總糖、還原糖和淀粉含量與碳代謝相關酶或基因之間存在密切關系[4-6]。碳代謝相關基因或酶活對土壤營養條件是敏感型的[7-8]，可利用改善土壤營養條件進行有效的調控，以達到提高煙葉品質的目的。目前關于煙葉淀粉積累及相關碳代謝酶活及基因變化的研究很少，大多集中在生態環境方面，對土壤腐熟秸稈營養效應相關的機理研究還未見報道。本試驗研究不同量腐熟秸稈對烤煙成熟期淀粉積累及相關基因表達的影響，旨在探索成熟期煙葉淀粉積累的機理，明確獲取優質煙葉的合適腐熟秸稈添加量，為進一步調控煙葉淀粉積累、提高煙葉品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試烤煙品種為NC89，品種由北方煙草育種中心提供。

1.2 試驗設計與處理

盆栽試驗于2012年在河南農業大學科教園區進行，供試土壤為河南省許昌市許昌校區的耕作層土壤，土壤類型為黃褐土，質地為壤土；土壤有機質含量 12.10 g·kg-1，堿解氮含量 50.20 mg·kg-1，速效鉀含量 130.70 mg·kg-1，速效磷含量 7.80 mg·kg-1，pH為8.05。

供試秸稈為人工發酵后的小麥秸稈，秸稈的人工發酵方法為：供試秸稈采自河南襄縣2011年收獲的小麥秸稈，采用人工切割成長度10 cm左右，人工調節秸稈含水量保持在60%～70 %，然后采取堆垛發酵，堆垛時采取一層秸稈（15 cm）+ 3 cm的土+經過處理的腐熟劑（腐熟劑與土混勻，增加腐熟劑的均勻度），堆垛高度為120 cm，發酵過程中每隔10天進行1次翻垛處理。當秸稈顏色變黑，同時用手一拉，成拉絲狀斷裂時，為完全腐熟狀態。腐熟劑為鶴壁恒隆態生物科技有限公司生產的HM高效腐熟劑。發酵時間從2012年3月5日開始，4月15日發酵結束。腐熟后小麥秸稈全碳含量為19.48 %，全氮含量為0.598 %，C/N為32.6。

試驗用盆規格為45×50 cm（直徑×深度），試驗設3個秸稈用量水平CK（0 g/盆）、T1（80 g/盆）和T2（160 g/盆），其中T1折算大田試驗秸稈用量300 kg/畝，T2折算大田試驗秸稈用量600 kg/畝。秸稈稱重前采用鼓風干燥箱在40 ℃條件烘干3 h，相對含水量4.5 %。盆栽用土經自然風干后過0.5 cm×1 cm網篩備用，每盆裝土20 kg。在移栽前一周將秸稈、土壤和肥料混勻后裝盆，均勻澆水至土壤相對含水率在90%左右。每個處理30盆，隨機排列，共計90盆。試驗于2012年5月5日移栽，純氮用量3 g·pot-1，N:P2O5:K2O=1:1.5:3。

1.3 樣品采集

采集中部葉（10～12葉位），移栽后60 d取第1次樣品，此時煙葉處于旺長后期，第1次取樣后第2天安排打頂，即移栽后61 d開始打頂，隨后在移栽后75 d和90 d各取1次樣品，整個試驗過程共取樣3次，其中移栽后90 d時中部煙葉已到成熟采收期。選擇5株長勢一致的煙株，每株取1片煙葉，混合取樣。每個時期3個重復。迅速置于液氮中，于-80℃冰箱凍存，用于基因表達研究和酶活分析；同時取組織樣品，用于煙葉細胞超微結構分析。烤后樣還原糖、總糖和淀粉含量的測定選取密集烤房三段式烘烤工藝烘烤后的C3F作為測試樣品。

1.4 試驗方法

1.4.1 淀粉粒觀察[9]

選取生長發育良好的中部葉1 mm～3 mm，采用5 %戊二醛溶液固定，于冰箱內4℃保存。采用透射電鏡觀察淀粉粒超微結構，并拍照。

1.4.2 酶活性測定

將0.2 g葉片放入8 mL 1%的NaCl中研磨為勻漿后 3000 r/min 離心10 min，參照 Xue 等[10]的方法測定轉化酶活性；參照 Doehlert 等[11]的方法等測定淀粉酶活性。

1.4.3 還原糖、總糖和淀粉含量測定[12]

取新鮮煙葉，去主脈，在105 ℃烘箱中烘烤15 min，60℃下烘烤2～3 h至煙葉到恒重。采用德國seal AA流動分析儀測定含量；其中還原糖和總糖為烤后樣。

1.4.4 基因表達分析

選取生長發育良好的中部葉，每次取樣將來源于不同煙株的5片葉混合以減少試驗誤差，所取葉片迅速置于液氮中冷凍保存。采用Trizol法提取煙草總RNA,樣品通過隨機引物法反轉錄合成cDNA。根據Genbank發布的蔗糖合成酶基因（SS）、蔗糖轉運蛋白基因（SUT1）、蔗糖轉化酶基因（INV）、焦磷酸化酶基因（AGPase）、顆粒結合型淀粉合成酶基因（GBSSI）和內參基因（L25）的序列設計各基因擴增引物，進行RT-PCR。

表1 煙草碳代謝途徑關鍵基因RT-PCR引物序列Tab. 1 RT-PCR primer sequences of tobacco carbohydrate metabolism

1.5 數據處理

采用Sigmplot10.0和SPSS 12.0進行數據處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同量腐熟秸稈對移栽后90 d中部葉片細胞淀粉粒積累的影響

圖1 移栽后90 d煙草中部葉片葉綠體內淀粉粒超微結構觀察（×1000）Fig. 1 Ultrastructure of starch grains in chloroplast of middle leaf tobacco 90 days after transplanting

在煙株生長過程中，對中部葉位移栽后90 d的葉片取樣，進行細胞超微觀察，比較3個土壤狀態下葉片采收時淀粉粒的積累和降解情況。結果如圖1所示：由圖1可以看出，3個處理中部葉片細胞均開始降解，淀粉粒顆粒數量多且體積大，分散在胞質中，形狀、結構不規則；葉綠體被膜及葉綠體類囊體片層間分布有一些高電子密度嗜鋨物質。3個處理相比，T1和T2處理相對于CK處理淀粉降解較充分，嗜鋨顆粒數目明顯較多。

2.2 不同量腐熟秸稈對成熟期烤煙中部葉碳代謝關鍵物質的影響

對添加不同量腐熟秸稈下葉片發育過程中的淀粉含量進行檢測，結果見表2。成熟期煙葉淀粉含量處于上升趨勢，在移栽后60 d 時T1和T2處理含量均顯著高于對照CK，數據分析顯示達到顯著水平（P＜0.05）。移栽后60 d對照CK淀粉含量迅速增加，T1和T2處理增加相對緩慢，在移栽后75 d和90 d時兩個處理均低于對照CK，烘烤后煙葉也低于對照，這可能與成熟期淀粉的降解有關。本研究對3個處理烤后樣品進行分析，烤后樣T1和T2處理淀粉含量仍顯著低于對照（P＜0.05），但是總糖和還原糖卻顯著高于對照CK（P＜0.05），尤其是總糖比對照提高了12.98%～23.93 %。

表2 不同量腐熟秸稈處理中成熟期烤煙中部葉還原糖、總糖和淀粉的含量（殺青樣和烤后樣）Tab. 2 Content of reducing sugar, total sugar and starch in middle leaf tobacco under different application rates of rotten straw(samples after deactivation of enzymes and samples flue-cured)

2.3 不同量腐熟秸稈對成熟期烤煙中部葉碳代謝關鍵基因表達的影響

圖2 不同量腐熟秸稈處理中成熟期烤煙中部葉碳代謝關鍵基因的表達分析Fig. 2 Expression analysis of key genes in the carbohydrate metabolism of middle leaf tobacco under different application rates of rotten straw

為了檢測不同量腐熟秸稈對成熟期烤煙中部葉碳代謝關鍵基因表達的影響，本試驗利用RT-PC技術對蔗糖合酶基因（SS）、蔗糖轉運蛋白基因（SUT1）、轉化酶基因（INV）、焦磷酸化酶基因（AGPase）和顆粒結合型淀粉合成酶基因（GBSSI）進行轉錄水平的表達分析，結果如圖2所示?？梢钥闯鰺熑~移栽后60 d到90 d這段時期碳代謝途徑關鍵基因SS、SUT1、INV、AGPase和GBSS I均出現一個先增加后降低的趨勢。對3個處理進行基因表達比較發現T1和T2處理碳代謝關鍵基因除轉化酶基因（INV）外，其余基因表達均顯著高于對照（CK），尤其是在煙葉移栽后75 d時T1處理GBSSI和AGPase基因表達顯著高于T2和對照（CK）。這表明添加不同量腐熟秸稈可以增加成熟期煙葉的淀粉合成代謝能力。

2.4 不同量腐熟秸稈對成熟期烤煙中部葉碳代謝關鍵酶活性的影響

在煙葉成熟期中部葉片發育過程中，對碳代謝關鍵酶蔗糖轉化酶和淀粉酶活性進行檢測，結果如圖3所示：由圖3A可以看出淀粉酶活性變化在3個處理中均呈單峰曲線，整體趨勢一致。隨著葉片發育淀粉酶活性逐漸上升，在移栽后75 d時達到最大值，隨后迅速降低。T1和T2處理淀粉酶活性在移栽后60 d時略低于對照（CK），而在移栽60 d以后顯著高于對照（CK）。這表明T1和T2處理成熟期淀粉降解速度遠遠高于對照（CK）。由圖3B可以看出轉化酶活性在成熟期3個處理中均呈單峰曲線，但3個處理之間差異不顯著，這和本研究檢測的轉化酶基因表達結果相一致（圖2）。

圖3 不同量腐熟秸稈處理中成熟期烤煙中部葉碳代謝關鍵酶的活性Fig. 3 Activity of key enzyme in carbohydrate metabolism of middle leaf tobacco under different application rates of rotten straw

3 討論

植物碳水化合物的生物合成受到多因素的影響。大量的研究表明煙草葉片碳水化合物的含量也受到光照、溫度 、干旱、海拔高度等生態環境因素的影響[13-15]。本研究對田間不同量腐熟秸稈下煙草植株成熟期中部葉蔗糖與淀粉合成相關基因的表達水平、酶活性、總糖含量、還原糖及淀粉含量進行研究分析。發現土壤添加腐熟秸稈有利于成熟期煙葉碳代謝途徑的進行，降低了烤后煙葉的淀粉含量，增加了總糖和還原糖含量，對提高煙葉品質具有重要意義。

蔗糖是高等植物光合產物運輸的主要形式, 經韌皮部運輸到需要能源和碳源的組織細胞, 為細胞生長發育提供能源和碳源，在這個過程中蔗糖轉運蛋白起關鍵作用。石永春等[16]研究表明，低溫增加了煙草葉片SUT的表達量，有利于煙葉中蔗糖的積累。Burkle等[17]通過抑制煙草的 SUT表達而導致維管束中蔗糖含量降低，開花延遲。本研究表明通過土壤添加不同量腐熟秸稈可以增加蔗糖轉運蛋白基因的表達，這預示著添加腐熟秸稈可能增強蔗糖轉運蛋白的活性，從而有利于葉片盡量轉運蔗糖，以滿足各種代謝的需求，這和本試驗檢測到最終T1和T2處理烤煙中總糖和還原糖比對照顯著增加相一致。

對植物體內淀粉合成代謝的研究表明，蔗糖合成酶（SS）和轉化酶（INV）都具有催化蔗糖降解功能。蔗糖和淀粉的代謝緊密相關，SS主要調節蔗糖的降解，為淀粉合成提供底物，其活性的高低與淀粉積累量相一致[18]；而轉化酶（INV）被認為是控制淀粉合成的關鍵酶[17]；另外，焦磷酸化酶（AGPase）為淀粉生物合成的限速酶，該酶活性的大小決定淀粉合成的速率和最終合成量的多寡[20-21]；因此，這3個基因的表達及酶活性大小意味著功能葉片中內含物積累的狀況。本研究發現T1和T2處理均顯著增加了蔗糖合成酶（SS）基因和焦磷酸化酶基因（AGPase）的表達活性，而轉化酶基因（INV）表達變化差異不大，這和本試驗測定的轉化酶活性結果相一致，推測添加腐熟秸稈對成熟期葉片淀粉代謝途徑的影響可能主要依賴于蔗糖合成酶（SS）和焦磷酸化酶（AGPase）；雖然T1和T2處理增加了淀粉合成的能力，但是由于這兩個處理中淀粉酶活性也增強了，推測其分解淀粉的速度可能大于其合成速度，所以導致最終本研究檢測到的葉片淀粉含量仍低于對照CK，這和細胞超微結構觀察結果相一致。

另外，本研究對顆粒結合型淀粉合成酶基因（GBSSI）的表達進行了檢測，表明T1處理的GBSSI基因表達量在成熟后期顯著高于T2和CK，GBSSI作為顆粒結合型淀粉合成酶，緊密結合在淀粉粒上，通過 a-1,4-D-糖苷鍵將ADPG中的葡萄糖殘基加到引物的非還原端，形成線性大分子[12]。GBSSI在T1處理煙葉中的活躍表達，說明T1處理煙葉中直鏈淀粉含量可能較高。但是直鏈淀粉含量的差異是否是T1處理成熟期煙葉淀粉含量顯著低于對照CK的原因還需要進一步的驗證。

4 結論

土壤添加腐熟秸稈有利于成熟期煙葉碳代謝，從而提高了煙葉的品質。至于土壤添加腐熟秸稈是通過增加土壤養分或通過改變土壤的物理和化學性狀（土壤的pH、容重、持水特性等）來改變碳代謝相關基因和酶活的變化還需要進一步的深入研究來證實，這也是本研究下一步工作的重點。

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Preliminary report on effect of applying rotten straw fertilizer on carbon metabolism in maturing flue-cured tobacco

JIA Hongfang1, CHEN Hongli1, HUANG Huagang2, YANG Yongxia1, CUI Hong1，LIU Guoshun1
1 College of Tobacco Science, Henan Agricultural University; National Tobacco Cultivation, Physiology and Biochemistry Research Centre, Zhengzhou 450002, Henan, China；2 Bijie Municipal Tobacco Company, Bijie 551700, Guizhou, China

Tobacco variety NC 89 was sampled to investigate effect of applying rotten straw fertilizer on starch accumulation, enzymes activity of carbohydrate metabolism and expression of key genes in maturing flue-cured tobacco. Results showed that application of rotten straw fertilizer added in soil had significant impact on content of reducing sugar, total sugar and starch in middle tobacco leaves. It increased amylase activities while exerted little impact on invertase activities. It also increased expression level of starch biosynthesis-related genes and enzymatic activity ofSS, SUT1, AGPase, andGBSSI, thereby carbohydrate metabolism was facilitated.

tobacco; rotten straw fertilizer; carbohydrate metabolism

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.04.010

S572.06 文獻標志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）04-0048-05

中國煙草總公司特色優質煙葉開發重大專項濃香型項目（110201101001 Ts-01）

賈宏昉（1982—），博士，講師，主要從事植物營養分子遺傳方面的研究，Email: jiahongfang@126.com

劉國順（1954—），教授，博士生導師，主要從事煙草生理生化方面研究，Email: liugsh1851@163.com

2013-09-24