基于高密度SSR連鎖群的煙草致香物質(zhì)關(guān)聯(lián)分析

任民，張長靜，蔣彩虹，程立銳，賈興華，楊愛國

中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點實驗室，青島266101

基于高密度SSR連鎖群的煙草致香物質(zhì)關(guān)聯(lián)分析

任民，張長靜，蔣彩虹，程立銳，賈興華，楊愛國

中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草基因資源利用重點實驗室，青島266101

煙葉致香物質(zhì)是烤煙品質(zhì)及香型風格的物質(zhì)基礎(chǔ)，是煙草品質(zhì)改良的重點之一。采用氣相色譜方法，對11份不同香型風格的煙草種質(zhì)進行了52種致香成分的檢測，同時采用1條高密度連鎖群上的62個SSR位點對其進行了分子標記位點分型。通過標記-性狀關(guān)聯(lián)分析，發(fā)掘到17種煙草致香物質(zhì)的24個關(guān)聯(lián)位點。大多數(shù)位點關(guān)聯(lián)到了多種致香成分。對供試材料的連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)該連鎖群存在2個單倍型，單倍型tsHap1_1由位點52429和53840組成，未發(fā)現(xiàn)其與致香物質(zhì)相關(guān)聯(lián)；單倍型tsHap1_2由3個相鄰的位點61443、52305和55052組成，總長度3.012cM，研究發(fā)現(xiàn)該單倍型與9種致香物質(zhì)關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)掘的關(guān)聯(lián)位點和單倍型，可用于煙草高香氣育種分子標記輔助選擇。

煙草；致香物質(zhì)；分子標記；關(guān)聯(lián)分析；單倍型

煙草作為典型的嗜好性作物，煙葉致香物質(zhì)對其品質(zhì)及香型風格有著非常重要的影響。煙葉在生長發(fā)育及其調(diào)制過程中會積累起大量的致香物質(zhì)，并在不同類型或品種間存在著顯著的差異。致香物質(zhì)的含量及組成除受到生態(tài)條件、調(diào)制措施等外部環(huán)境影響外，品種間的基因型差異是其遺傳基礎(chǔ)，也是影響香吃味的第一因子[1]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些影響煙葉致香物質(zhì)的遺傳性狀[2]，初步探明了部分致香物質(zhì)的遺傳規(guī)律[3-5]。隨著植物次生代謝網(wǎng)絡的日漸清晰，煙草多個致香物質(zhì)代謝途徑關(guān)鍵酶的基因也已被同源克隆，并明確了表達模式[6-9]。但是相對煙草致香物質(zhì)的種類和數(shù)量，目前已經(jīng)發(fā)掘的相關(guān)基因仍遠無法滿足實際需要，并極大的限制了分子育種技術(shù)在烤煙品質(zhì)育種中的應用。此外致香物質(zhì)成分復雜，數(shù)量眾多，按照傳統(tǒng)的方法進行基因發(fā)掘，所需分離群體的群數(shù)將極為龐大，這也成為制約致香物質(zhì)基因發(fā)掘研究的一個重要因素。

近年來，隨著基因組學技術(shù)的發(fā)展，關(guān)聯(lián)分析技術(shù)作為一種新的基因發(fā)掘理論與技術(shù)體系，在植物基因克隆領(lǐng)域得到了快速的發(fā)展。基于關(guān)聯(lián)分析利用一套自然群體即可開展規(guī)模化的生物性狀調(diào)控基因發(fā)掘，可有效的解決來自群體、親本、性狀等多方面的限制因素[10]。同時，煙草分子標記的數(shù)量目前已較為豐富。2011年發(fā)布了煙草高密度SSR遺傳連鎖圖譜[11]，隨該圖譜公開了5000多對SSR標記，其中2700多對分別位于24條連鎖群，該圖譜的發(fā)布為煙草基因發(fā)掘與克隆提供了豐富的分子標記。本研究利用該高密度遺傳連鎖圖譜，探索基于關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘煙葉致香物質(zhì)調(diào)控基因和遺傳位點的技術(shù)途徑與方法，以期構(gòu)建相關(guān)技術(shù)體系，為大規(guī)模發(fā)掘煙草致香物質(zhì)和其他重要性狀基因奠定理論與方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究選用的供試品種見表1，供試材料種植于中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所即墨試驗基地，田間栽培及各項管理措施均一致，于煙葉成熟期采收單株葉片，在密集烤房內(nèi)烘烤調(diào)制。

1.2 致香成分氣相色譜（GC）檢測

烤后煙葉致香物質(zhì)檢測采用氣相色譜法[12]，共檢測了52種致香物質(zhì)（表2），包括18種酸性成分，22種中性成分和12種堿性成分。

表1 本研究供試材料列表Tab. 1 Experiment samples

表2 本研究所檢測的52種致香物質(zhì)及其屬性Tab. 2 52 aroma constituents detected in the experiment

1.3 SSR引物

本研究SSR位點及其引物序列來自煙草高密度SSR遺傳連鎖圖譜的1號連鎖群[11]，共計62個遺傳位點，總長度130.043 cM，平均距離2.097 cM，最大間距8.626 cM，最小間距0.269 cM。

1.4 DNA提取

采用TIANGENE? Plant Genomic DNA Kit 提取供試材料全基因組DNA。

1.5 PCR反應體系

PCR 總反應體系為 10 μL，其中 30～50 ng/μL DNA 模板 1 μL，2× DreamTaq ? Green PCR Master Mix 5 μL，2 μmol/L 正反向引物混合工作液 1 μL，加ddH2O至10 μL。所用試劑購自MBI。PCR反應在96孔ABI Veriti梯度基因擴增儀上按以下程序運行：首先 94 ℃預變性 5 min；94 ℃ 15s，55 ℃ 15 s，72℃30 s 共32個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.6 電泳檢測

完成PCR擴增48 h內(nèi)，取2 μL PCR產(chǎn)物在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上，恒電壓850 V電泳90 min。用稍加改進的NaOH銀染方法[13]對電泳后的聚丙烯酰胺凝膠進行染色顯影。

1.7 統(tǒng)計分析

供試群體遺傳多樣性指數(shù)的計算采用POPGENE軟件[14]。材料群體遺傳結(jié)構(gòu)分析采用STRUCTURE 2.3.2 軟件[15]，其Length of burn-in period和Number of MCMC Peps after Burn-in均設為100,000次。分組方式即K值從1到10，迭代10次。通過計算ΔK值[16]，確定最終的分組方式。標記-性狀關(guān)聯(lián)分析采用TASSEL軟件（v2.1）[17]基于“MLM”模型進行運算，并代入群體結(jié)構(gòu)，遺傳位點間連鎖不平衡性分析采用“Link. Diseq.”模塊。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性

本研究在63個SSR位點上，共得到37個多態(tài)性位點，多態(tài)性比例58.7%。總共擴增出82個多樣性條帶，平均每個位點2.216個等位。編號為61342的位點多態(tài)性最高，達0.6400，編號為52969的位點多樣性最低，僅為0.095，37個多樣性位點的平均多樣性指數(shù)為0.3314。

表3 多態(tài)性位點的遺傳多樣性指數(shù)Tab. 3 Genetic diversity index of polymorphic loci

2.2 烤后煙葉致香成分檢測結(jié)果

本研究利用氣相色譜技術(shù)共對52種致香成分進行了檢測。在供試材料中86-3002（PZ6）的致香物質(zhì)總含量最高，達到672.99 μg/g；由于青梗（PZ2）的新植二烯含量在所有供試品種中最低，導致其致香物質(zhì)總含量僅為282.46 μg/g，為所有供試材料的最低值。在各種致香成分中新植二烯的平均含量最高，達284.60 μg/g，2-甲基丙酸的平均含量最低，平均僅為：0.0189 μg/g。平均含量最高的前十種成分依次為：新植二烯、棕櫚酸（十六酸）、吲哚、2-乙酰吡咯、2-乙酸苯乙酯、巨豆三烯酮3、金合歡醇、苯甲醇、2-乙酰吡啶、巨豆三烯酮2。

2.3 標記-性狀關(guān)聯(lián)分析

本研究利用62個SSR標記對52種致香物質(zhì)進行了致香物質(zhì)標記-性狀關(guān)聯(lián)分析。首先進行了群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，當K=4時，ΔK值最高。然后代入上述遺傳結(jié)構(gòu)，進行了標記-性狀關(guān)聯(lián)分析。在供試連鎖群上，共發(fā)掘到17種致香成分的24個關(guān)聯(lián)位點（圖1），相關(guān)致香成分分別為：丁酸（★）、3-甲基戊酸（☆）、2,3-二甲基吡嗪（■）、月桂酸（□）、新植二烯（●）、2-甲基丙酸（○）、2-甲基-2-庚烯-6-酮（▲）、苯甲醛（△）、2-甲基四氫呋喃-3-酮（◆）、異戊酸（◇）、巨豆三烯酮2（?）、巨豆三烯酮4（?）、庚酸（?）、2-乙酰基-1-甲基吡咯（▼）、喹啉（▽）、2,5-二甲基吡嗪（⊕）、2-乙酰吡咯（?）。各關(guān)聯(lián)SSR位點的關(guān)聯(lián)成分和數(shù)量各不相同，但多數(shù)與多種致香成分相關(guān)，只有6個位點關(guān)聯(lián)到的致香成分在3種以內(nèi)。其中3個相鄰的位點61443、52305和55052關(guān)聯(lián)到的致香成分最多，達到9種，且成分相同。

圖1 致香成分遺傳連鎖圖Fig. 1 Genetic linkage map of aroma constituents

2.4 SSR位點單倍型（Haplotype）分析

通過對供試群體SSR分型結(jié)果進行連鎖不平衡性（LD）分析，在供試連鎖群上發(fā)掘到2個SSR單倍型，涉及5個SSR位點。單倍型tsHap1_1由位點52429和53840組成，在本研究中未發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)性狀。單倍型tsHap1_2由3個相鄰的位點61443、52305和55052組成，總長度3.012 cM，在本研究中發(fā)現(xiàn)與9種致香物質(zhì)關(guān)聯(lián)（圖1）。該單倍型在每個組成位點上均擴增出2種等位變異，按帶型大小分別記為Allel-1和Allel-2。單倍型tsHap1_2在供試群體中共檢測到2種組合方式，分別是tsHap1_2A（61443Allel-2+ 52305Allel-1+ 55052Allel-2） 和 tsHap1_2B（61443Allel-1+ 52305Allel-2+ 55052Allel-1）。在品種PZ1和PZ2中為tsHap1_2A，在其他供試品種中為tsHap1_2B。由圖2可知，tsHap1_2A對致香物質(zhì)2-甲基-2-庚烯-6-酮、2-甲基丙酸、丁酸、月桂酸和2,3-二甲基吡嗪含量的遺傳貢獻為正向，即利用tsHap1_2單倍型對群體分類后，含有tsHap1_2A單倍型的群體上述成分的含量高于tsHap1_2B群體；對2-甲基四氫呋喃-3-酮、苯甲醛、3-甲基戊酸和新植二烯含量的遺傳貢獻為負向。該單倍型組成位點52305在群體擴增中帶型較為穩(wěn)定、清晰，可以作為tag SSR標記使用。

表4 本研究發(fā)掘到的2個煙草SSR單倍型Tab. 4 tsHap1_1 and tsHap1_2

圖2 tsHap1_2單倍型對關(guān)聯(lián)致香成分的遺傳效應Fig. 2 Genetic effects of tsHap1_2 on associated aromaconstituents

3 結(jié)論與討論

本研究通過一組自然群體，利用標記-性狀關(guān)聯(lián)分析的技術(shù)途徑開展了煙草致香物質(zhì)關(guān)聯(lián)位點發(fā)掘研究，共找到17種致香物質(zhì)的24處關(guān)聯(lián)位點。該研究初步探索了一套復雜性狀調(diào)控基因或遺傳位點發(fā)掘的新途徑。即：1）根據(jù)研究目標構(gòu)建自然群體，該群體應該盡可能多的覆蓋目標性狀變異范圍，同時兼顧到其他性狀的研究；2）開展目標性狀的精準鑒定；3）對供試群體進行標記位點基因分型，標記密度越高，分析效果越好；4）在進行關(guān)聯(lián)分析之前，應開展群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，以消除遺傳結(jié)構(gòu)對表型變異的影響[18]；5）結(jié)合表型鑒定開展標記-性狀關(guān)聯(lián)分析，關(guān)聯(lián)位點的選擇除了可以利用顯著性水平判定外，還可利用關(guān)聯(lián)位點的重復性以及其他數(shù)據(jù)的規(guī)律性協(xié)助選擇。

致香物質(zhì)是一類復雜的表型變異，涉及成分眾多，且以多基因調(diào)控為主。本研究發(fā)現(xiàn)利用關(guān)聯(lián)分析技術(shù)進行類似復雜性狀的基因發(fā)掘，不但技術(shù)上可行，而且具有一定的優(yōu)勢。首先，一套研究群體即可滿足不同性狀的基因發(fā)掘研究，能夠顯著降低研究成本。如果利用人工群體，每個群體僅能針對有限的性狀和成分，面對致香物質(zhì)這類復雜性狀時，必須構(gòu)建多套人工群體，因此研究成本的增加將會非常明顯；其次，自然群體是天然的穩(wěn)定群體，省去通過雜交、自交構(gòu)建群體的步驟，因此可以有效縮短研究周期[19]；最后，自然群體相當于一個豐富的自然變異基因池，每個基因座基本可以囊括全部等位變異，從而可以突破連鎖分析每個基因座只有2種等位變異的限制，進而可以更加精細的研究每種等位變異的遺傳貢獻，結(jié)合育種目標找到最優(yōu)等位變異。

當前，致香物質(zhì)的檢測雖然實現(xiàn)了較高的自動化，但成本依然偏高，成為了限制這類研究大規(guī)模開展的一個重要因素。因此，在今后的研究中應當進一步優(yōu)化檢測技術(shù)，以大幅降低檢測成本。還應不斷探索新型檢測方法，如利用電子鼻等新型儀器設備，開展田間的快速檢測。在擴大群體的基礎(chǔ)上，還有必要不斷提高標記密度和基因組覆蓋度，隨著煙草基因組測序工作的基本完成[20]，更高密度的分子標記，如SNP將日趨成熟[21]。可以預計隨著致香物質(zhì)檢測技術(shù)和高通量分子標記的迅速發(fā)展，煙草致香物質(zhì)基因發(fā)掘?qū)瓉硇碌耐黄啤?/p>

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Association analysis of tobacco aroma constituents based on high density SSR linkage group

REN Min, ZHANG Changjing, JIANG Caihong, CHENG Lirui, JIA Xinghua, YANG Aiguo
Key Laboratory for Tobacco Gene Resources, Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences,Qingdao 266101, China

Eleven tobacco varieties with different aroma types were selected as samples to examine 52 aroma constituents by Gas Chromatography. 62 simple-sequence repeat (SSR) markers which come from a high density tobacco SSR linkage group were scanned.Marker-trait association analysis showed that there were 24 loci significantly associated with 17 types of aroma constituents and each locus was often associated with several aroma constituents. LD analysis revealed two haplotypes at this linkage group, which were tsHap1_1 and tsHap1_2. The former consisted of locus 52429 and 53840 while the latter comprised locus 61443, 52305 and 55052, occupying 3.012cM.9 aroma constituents were found to be associated with tsHap1_2. Therefore, the associated SSR loci and haplotype with aroma constituents are both beneficial for marker assistant selection in tobacco leaf quality improvement.

tobacco; aroma constituents; molecular markers; association analysis; haplotype

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.04.017

Q81 文獻標志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）04-0088-06

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項（201203091）；煙草重要性狀基因發(fā)掘及功能標記開發(fā)(110201301008)

任民，博士，副研究員，從事煙草分子育種研究，Tel:0532-88702169，Email:renmin@caas.cn

楊愛國，博士，副研究員，從事煙草分子育種研究，Tel:0532-88702138，Email:yangaiguo@caas.cn

2013-07-09