PAK4在乳腺結構紊亂中的表達及與鉬靶X線的相關性

畢研青+郝敏+田萌子+劉效方+孫文凱+王琳琳

【摘要】 目的：觀察PAK4在乳腺結構紊亂組織中的表達，并探討其與臨床影像學在乳腺癌早期診斷中的相關性。方法：對2012年1月-2013年10月在東營市人民醫院乳腺科住院手術的150例女性乳腺疾病患者進行了回顧性分析。本院病理科取得患者乳腺標本蠟塊，部分患者爭取患者同意后行穿刺取乳腺樣本。采用HE染色和PAK4免疫組化染色，制作切片在光鏡下觀察。結果：非增生性病變與乳腺增生伴不典型增生和乳腺癌組進行兩兩比較，差異有統計學意義（P<0.05）。乳腺增生伴不典型增生與乳腺癌比較差異有統計學意義（P<0.05）。乳腺癌組中PAK4染色的表達與臨床影像學鉬靶與超聲診斷呈正相關性。結論：提示PAK4與乳腺癌演進和轉移密切相關，對結構紊亂的乳腺疾病有指導手術治療的意義。

【關鍵詞】 乳腺結構紊亂； 乳腺癌； 手術指征； 影像學； 分子生物學； PAK4

The Role of PAK4 in the Indications of Breastsurgical Treatment and the Correlation between Its and Molybdenum Target X-ray/BI Yan-qing，HAO Min，TIAN Meng-zi，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（32）：004-007

【Abstract】 0bjective：To investigatethe role of PAK4 in the indications of breast surgical treatment of structural disorder mammary gland and to explore its correlation with clinical imaging in the diagnosis of early breast cancer.Method：150 patients with mammary gland disease who have had surgery treatment were collected from January 2012 to December 2013.The paraffin-embeded samples were obtained from our hospital.HE staining was used to investigate the structure of Mammary gland. PAK4 immunohistochemical staining was used to investigate the expression of different types of breast disease under light microscope.Result：There were obvious difference between the hyperplasia of mammary glands with atypical hyperplasia and the breast cancer about PAK4 immunohistochemical staining.And compared with non proliferative breast disease，the differences were significantly. PAK4 expression in breast cancer group was positively correlation with mammography and ultrasound diagnosis. Conclusion：The PAK4 is closely related to the evolution and transfer of breast cancer and has great significance in the breast surgical treatment in structural disorder of mammary gland disease.

【Key words】 Structural disorder mammary gland； Breast carcinoma； Indications of surgical treatment； Iconography； Molecular biology； PAK4

First-authors address：The Peoples Hospital of Dongying，Dongying 257091，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.32.002

乳腺結構紊亂是乳腺疾病常見的影像學改變，也是乳腺癌演變過程中的一個階段，而乳腺癌是危害婦女健康的主要腫瘤。全世界每年約有120萬～140萬婦女發生乳腺癌，約有50萬婦女死于該病。雖然乳腺癌的治療獲得了較快的發展，但我國目前乳腺癌的治療效果仍較差，相比于美國婦女乳腺癌確診時80%以上為早期乳腺癌，我國婦女乳腺癌確診時70%～80%患者已是中晚期，此時手術創傷較大且需要術后行化學治療，治療費用較高，對患者的心理及生理影響較大?；颊咝g后的生存期短，生存質量較差。因此，提高我國乳腺癌遠期治愈率的關鍵，取決于對乳腺癌的早期發現、早期診斷、早期治療。隨著影像學的發展，更多的檢測手段應用于乳腺病的檢查，更多的良性病變被檢測到，對評估某些特殊的乳腺影像學結構所致乳腺癌發病的風險性提高了準確性，對指導臨床治療具有重要意義。隨著現代分子生物學的發展大家逐漸認識到，真核細胞信號傳導過程中，通路蛋白的磷酸化和去磷酸化化學修飾之間的平衡在細胞正常信號轉導及腫瘤發生、發展過程中起著非常重要的作用，是信號通路調控的重要方式。對細胞增殖控制不當，未能區分并保持適當的細胞形狀和極性可發生癌性轉化，這些與控制細胞生長與凋亡的細胞內的信號傳導通路的失調密切相關。P21活化蛋白激酶（P21 activated protein kinases，Paks）在此途徑中扮演著關鍵的角色。用免疫組化方法檢測P21蛋白表達水平的變化，對于判斷乳腺增生到惡變在這一過程中的危險因素及早診斷乳腺癌、為臨床指導手術指征等具有重要的理論和實踐價值。國內已有通過對P21蛋白在乳腺正常組織及乳腺腺病與乳腺不典型增生組之間，乳腺不典型增生組與增生惡變組之間的檢測，對比統計差異相關方面的的研究[1]。

1 材料與方法

1.1 材料 選取本院2012年1月-2013年10月在東營市人民醫院乳腺科住院手術的150例女性乳腺疾病患者。全部患者術前均行B超、鉬靶檢查，提示乳腺結構紊亂，其中，非增生性病變50例，乳腺增生伴不典型增生病[平坦型上皮非典型性增生（FEA）導管上皮內腫瘤1A（DIN 1A）、非典型性導管增生（ADH）導管上皮內腫瘤1B （DIN 1B）]50例、乳腺癌50例，其中非增生病變為A組（年齡18～55歲），乳腺增生伴不典型增生病變為B組（年齡18～56歲），乳腺癌為C組（年齡29～75歲）。本院病理科取得患者乳腺標本蠟塊，部分患者爭取患者同意后行穿刺取乳腺樣本。

1.2 研究方法 將收集的蠟塊切片，每個標本切片2份，分別進行HE染色、PAK4免疫組織化學染色。免疫組化染色：（1）脫蠟入水（PBS洗2～3次，每次5 min）。（2）3%H2O2室溫孵育30 min（封閉內源性過氧化物酶）。（3）蒸餾水洗3次，5 min/次，浸入PBS 5 min。（4）抗原修復。（5）PBS洗3次，每次5 min。（6）滴加血清封閉液，放置于室溫下20 min。（7）傾去血清，不洗，滴加一抗，室溫37 ℃孵育l～2 h。（8）PBS洗3次，5 min/次。（9）滴加生物素標記的羊抗兔IgG抗體（二抗），37 ℃孵育10～30 min。（10）PBS洗3次，5 min/次。（11）滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育10～30 min。（12）PBS洗3次，5 min/次。（13）DAB-H2O2顯色5～10 min，隨時鏡檢（DAB用時新配）。（14）自來水沖洗10 min。（15）蘇木精復染2 min，鹽酸酒精分化，氨水處理。（16）自來水沖洗10～15 min。（17）脫水、透明、封片。光鏡下（100倍）對乳腺標本進行結構及免疫組化染色觀察。免疫組化染色PAK4染色液及Her2染液由abcam生物技術有限公司提供。

1.3 評價標準 PAK4主要在乳腺腺體細胞的胞漿和/或胞核表達，陽性細胞被染成棕黃色或深棕色，采用一抗來源的同科，動物兔的正常IgG作為陰性對照，以此判斷PAK4免疫染色的特異性；與陰性細胞對比鮮明。結果判斷參照Campo等的標準，結合具體染色強度和細胞染色百分率進行評分：著色弱為1分，著色中度為2分，著色強為3分，基本不著色為0分；著色細胞占總細胞數5%～25%為1分，26%～50%為2分，等于或大于51%為3分，5%以下為0分。最后以陽性細胞的百分比以及染色強度記分之和所得的總分進行結果判定[10-11]。0分為陰性；1、2分為弱陽性（+）；3、4分為中等陽性（++）；5分或5分以上為強陽性（+++）。抗體陽性標準：PAK4以3、4分（中等陽性，強陽性）以上為陽性，其余0分、1、2分（陰性，弱陽性）為陰性。免疫組織化學檢測結果由兩位病理學家在相同的判定標準下雙盲判定，相同判定結果直接納入統計，有差異的結果經另一位病理學家雙盲判定后取三人判定的平均值納入統計。鉬靶X線陽性判斷標準：鉬靶提示簇狀、泥沙樣鈣化或者毛刺樣、邊緣模糊的結節影，BI-RADS分級Ⅳ～Ⅴ級判斷為陽性結果。彩超陽性判斷標準：腫塊形態不規則，邊界不清，呈毛刺狀或蟹足狀，內部回聲不均勻，腫塊內見微小鈣化灶，腫塊后方回聲衰減、腫塊縱橫比>1，腫塊內血流信號Ⅱ～Ⅲ級，阻力指數（RI）>0.7，提示占位性病變者判斷為陽性結果。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析，采用等級資料多個獨立樣本和兩個獨立樣本非參數檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PAK4在三組乳腺疾病中的表達情況 PAK4在非增生性病變（A組）、乳腺增生伴不典型增生（B組）及乳腺癌（C組）中的陽性率分別為6%、40%、78%，三組間兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 PAK4在三組乳腺疾病中的表達情況

注：A組與B組比較，P<0.05，A組與C組比較，P<0.05，B組與C組比較，P<0.05

2.2 影像學特征及PAK4在50例乳腺癌中的表達情況 50例乳腺癌中PAK4、鉬靶、超聲陽性表達分別為39例（78%）、39例（78%）、41例（82%）。PAK4表達與鉬靶及彩超陽性結果呈正相關性（P>0.05）。見表2，圖1～4。

3 討論

據流行病學研究統計，乳腺不典型增生發展成為乳腺癌的危險性顯著增加。乳腺增生是最常見的乳腺疾病，又叫乳腺囊性增生癥。包括乳腺疼痛、乳腺小葉增生癥、纖維腺病、纖維化增生癥、乳腺癌（因為很多乳腺癌是由乳腺增生病惡變產生的）。臨床上約有50%婦女有乳腺增生的表現，一般多見于20～50歲的婦女[2]，特別是30歲以上未婚、未育、哺乳少、愛生氣的婦女。乳腺增生癥與乳腺癌的關系是患者最為關心的問題，也是眾多學者爭論與研究的焦點。早期及近來眾多的研究表明，相對于非增生性乳腺良性疾病而言，乳腺增生不伴非典型增生者有一個小幅增加的乳腺癌發病風險，而乳腺增生伴非典型增生的患者隨后發生乳腺癌的發病率明顯升高[3-5]。目前普遍采用“非增生性”與“增生性”病變來區分不同的危險性。非增生性病變，并不增加乳腺癌的發病率，而增生性病變發生乳腺癌的相對危險性就升高了，以伴有小葉或導管不典型增生者尤甚。

表2 影像學特征及PAK4在50例乳腺癌中的表達情況 例（%）

圖1 乳腺增生病，小葉腺體增生，外圍肌上皮細胞陽性，內側腺上皮細胞陰性（PAK4染色x100）

圖2 乳腺纖維腺瘤，纖維組織增生，擠壓腺體呈裂隙狀，腺體外圍肌上皮細胞陽性，內側腺上皮細胞陰性（PAK4染色X100）

圖3 原位癌，瘤細胞散在陽性，但導管外圍細胞均陽性（PAK4染色X100）

圖4 乳腺浸潤性癌，癌細胞胞膜、胞質陽性（PAK4染色×200）

眾所周知，影像學的檢查方法為目前早期發現、早期診斷乳腺癌的主要途徑。乳腺X線鉬靶攝影的操作原理是將乳房的三維結構投影為二維圖像平面，這種技術以其較好的病變突出性能、低價格、以及其簡單實用性使人們將它作為無癥狀女性對乳腺癌篩查的首選[6]。乳腺癌亦可呈片狀、不規則高密度影，但病變區及其周圍乳腺結構紊亂，纖維小梁增粗，可有簇狀鈣化灶，鈣化量多，每平方鈣化數目在10個以上，局部皮膚增厚、內陷[7]。超聲檢查無射線損傷，尤其適合妊娠、哺乳期婦女檢查及乳腺疾病的普查和隨訪。其與X線檢查相結合被稱為目前檢查乳腺癌的“黃金組合”。P21活化蛋白激酶（ P21 activated protein kinases， Paks）家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，最早是作為Rho GTP酶Cdc42和Racl的特異性結合物而被發現的[8]，PAK4在第二組PAK中最先被作為Rho GTP酶Cdc42的效應蛋白引起細胞骨架的的改變而被報道者[9]，隨后被發現PAK4可被Rho GTP酶單獨激活[10]，且其在細胞增殖、分化及轉化[11-13]、延長正常細胞壽命及促細胞的凋亡[14]、參與腫瘤細胞的轉移[15-17]和正向調節一些正常生理代謝等方面都起重要作用。PAK4能在多種癌細胞與腫瘤中呈高表達[18-20]，一些研究表明Pak4高轉化于纖維母細胞，同時也在上皮細胞轉化過程中起關鍵作用。目前，被廣泛研究的上皮細胞癌癥轉化的典型就是乳腺癌，大量的研究顯示該蛋白家族中的PAK4在乳腺癌組織中高表達，且遠高于在其他腫瘤中，且PAK4表達與乳腺癌和卵巢癌細胞的增殖和侵襲轉移呈正相關[21-23]。

本研究發現，乳腺非增生性病變、乳腺增生伴不典型增生、乳腺癌中的PAK4表達總體陽性率依次升高，采用等級資料多個獨立樣本和兩個獨立樣本非參數檢驗發現，乳腺增生伴不典型增生與乳腺癌中PAK4表達（圖1～4）差異有統計學意義，前兩者分別與乳腺非增生性病變相比，差異有統計學意義。筆者對50例乳腺癌患者術前的彩超及鉬靶診斷與PAK4染色情況進行了相關性研究發現，PAK4染色與鉬靶及彩超在早期診斷乳腺癌中呈正相關性。說明PAK4染色對于判斷乳腺增生性疾病到惡變在這一過程中的危險因素及早診斷乳腺癌、為臨床指導手術指征等具有重要的理論和實踐價值。筆者將進一步對乳腺良性疾病向乳腺癌發展過程中PAK4的變化進行系統的研究，以期將乳腺增生性疾病到惡變PAK4的測量做為手術指征的一重要指標。

參考文獻

[1]劉運江，梁志兵，王小玲.Skp2蛋白和P21蛋白在乳腺增生惡變過程中的表達及意義[J].醫學研究雜志，2008， 11（37）： 91-94.

[2] Goehring C， Morabia A. Epidemiology of benign breastdisease， with special attention to histologic types[J]. Epidemiol Rev， 1997， 19（23）：310-327.

[3] DupontW D， Page D L. Risk factors for breast cancer in women with proliferative breast disease[J]. N Engl J Med， 1985，312（241）： 146-151.

[4] Page D L， Dupont W D， Rogers L W， et al. Atypical hyperplastic lesions of the female breast： a long-term follow-upstudy[J]. Cancer，1985，55（45）：2698-2708.

[5] Geoffrey CKabat，Joan GJones， Neal Olson， et al.A multi-center prospective cohort study of benign breast diseaseand risk of subsequent breast cancer[J].Cancer Causes Control，2010，21（23）：821-828.

[6] Pisano E D，Gatsonis C，Hendrick E，et al.Diagnostic performance of digital versus film mammography for breast-cancer screening[J].New Engl J Med，2005，353（123）：1773-1883.

[7] 汪東方，曹然，朱彬.乳腺常見疾病的鉬靶X線診斷[J]. 影像診斷與介入放射學，2004， 13（3）：158.

[8] Manser E， Leung T， Salihuddin H， et al. A brain ser ine/threo nine protein kinase activated by Cdc42 and Rac1[J].Nature， 1994， 367（423）：40-46.

[9] Abo A， Qu J， Cammarano M S，et al.PAK4， a novel effector for Cdc42Hs， is implicated in the reorganization of the actin cytoskeleton and in the formation of filopodia[J]. EMBO J，1998，17，（12）：6527-6540.

[10] Paliouras G N， Naujokas M A， Park M.Pak4， a novel Gab1 binding partner， modulates cell migration and invasion by the Met receptor[J]. Mol Cell Biol，2009，29（12）： 3018-3032.

[11] Nekrasova T， Minden A. PAK4 is required forregulation of the cell-cycle regulatory protein p21， andfor control of cell-cycle progression[J]. J Cell Biochem，2011，112（7）：1795-1806.

[12] Callow M G， Clairvoyant F， Zhu S， et al. Requirement for PAK4 in the anchorage-independent growth of human cancer cell lines [J]. J Biol Chem， 2002， 277（1）：550-558.

[13] Liu Y， Chen N， Cui X， et al . The protein kinase Pak4disrupts mammary acinar architecture and promotesmammary tumorigenesis[J]. Oncogene ， 2010，29（44）：5883-5894.

[14] Eswaran J， Soundararajan M， Kumar R， et al .UnPAKing the class differences among p21-activatedkinases[J]. Trends Biochem Sci ， 2008，33（8）：394-403.

[15] Wells C M， Jones G E. The emerging importance of group Ⅱ PAKs [J]. Biochem J ， 2010， 425（3）：465-473.

[16] Siu M K， Chan H Y， Kong D S， et al . p21-Activatedkinase 4 regulates ovarian cancer cell proliferation，migration， and invasion and contributes to poorprognosis in patients[J]. Proc Natl Acad Sci U S A ， 2010，107（43）：18 622-18 627.

[17] Li Z， Lock J G， Olofsson H， et al . Integrin-mediatedcell attachment induces a PAK4-dependent feedbackloop regulating cell adhesion through modified integrinalpha v beta 5 clustering and turnover[J]. Mol Biol Cell，2010， 21（19）：3317-3329.

[18] Callow M G， Clairvoyant F， Zhu S，et al. Requirement for PAK4 in the anchorage-independentgrowth of human cancer cell lines[J]. J Biol Chem， 2002， 277（12）： 550-558.

[19] Chen S， Auletta T， Dovirak O，et al. Copy number alterations in pancreatic cancer identifyrecurrent PAK4 amplification[J]. Cancer Biol Ther， 2008，7（15）：1793-1802.

[20] Kimmelman A C， Hezel A F， Aguirre A J，et al. Genomic alterations link Rho family of GTPases to thehighly invasivephenotype of pancreas cancer[J]. Proc Natl Acad SciUSA， 2008，105（45）：19 372-19 377.

[21] Liu Y， Xiao H， Tian Y，et al. ThePak4 protein kinase plays a key role in cell survival andtumorigenesis in athymic mice[J]. Mol Cancer Res， 2008，6（12）：1215-1224.

[22] Kumar R， Vadlamudi R K. Emerging functions of P21-activated kinases in human cancer cells [J]. J Cell Physiol， 2002， 193 （2）： 133-144.

[23] Grigorios N P， Monica A N， Morag P. Pak4， a novel gab1 binding partner， modulates cell migration and invasion by the Met receptor？[J]. Mol Cell Biol， 2009， 29（11）： 3018-3032.

（收稿日期：2014-07-15） （本文編輯：陳丹云）