香連丸有效部位對腸黏膜屏障保護作用的實驗研究

陳兆群，蔡蔚斌，陳懷，陳展祥，方少虹

1.汕頭市中醫醫院藥劑科，廣東 汕頭 515031；2.汕頭市中醫醫院重癥醫學科，廣東 汕頭 515031；3.汕頭市中醫醫院外科，廣東 汕頭 515031

“腸道是應激反應的中心器官之一”這一論點越來越受人們的公認。目前國內現已有香連丸有效部位具有抗消化性潰瘍潰瘍[1-3]、抑制胃酸分泌、解痙、抗菌[4]、抗腹瀉[5]、抑制小腸推進、抗炎[6]等作用等藥理作用。但國內卻鮮有關于香連丸有效部位對腸保護作用的研究。本實驗通過研究香連丸有效部位對腸黏膜屏障的保護作用，初步分析其作用途徑及機制，為臨床防治腸炎提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用體重2～3kg的清潔級雄性新西蘭兔45只，由汕頭大學醫學院動物實驗部提供，屏障系統個別籠養，自由攝食、飲水。

1.2 動物模型建立與分組 將所選家兔隨機分為三組：假手術組(I組)、模型對照組(Ⅱ組)和香連丸組(Ⅲ組)，每組15只。3組家兔術前12h禁食，禁水4h，清洗動物，備皮。動物稱重后耳緣靜脈給予鹽酸氯胺酮(上海第一生化藥業有限公司)20～25mg/kg，分離頸內靜脈插管。3組動物按無菌操作原則取上腹正中切口4～5cm，輕輕翻出十二指腸。Ⅰ組動物放回十二指腸，逐層關閉腹腔。Ⅱ-Ⅲ組動物在膽總管結合點上游約1cm處鈍性分離膽總管，用4號絲線提起并結扎膽總管，回納組織后，逐層關閉腹腔。3組動物均禁食12小時后開放飲食，Ⅱ組給予香連丸有效部位(萸黃連總生物堿和木香揮發油)。萸黃連生物堿從毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch(吳茱萸制)中提取，總生物堿含量達50%以上，木香揮發油是從菊科植物云木香Aucklangia lappa Decne中提取，木香烴內酯和去氫木香內酯含量之和達50%。香連丸組大鼠每天灌胃1.168g/kg，Ⅰ組和Ⅲ組動物每天灌胃同體積生理鹽水。

1.3 標本采集及預處理 三組動物于術前及術后72h取血后處死。血漿分離保存于-70℃冰箱內待檢測。取距回盲部約5cm處回腸組織，沿縱軸剪開腸管，清洗腸內容物，濾紙吸干水后福爾馬林溶液固定。1.4 血膽紅素水平檢測 用GAMSTAR 自動生化分析儀(美國產)測定血清總膽紅素和直接膽紅素，部分結扎膽總管后引起明顯的高膽紅素血癥，檢驗梗阻性黃疸模型是否建立成功。

1.5 血漿內毒素、二胺氧化酶(DAO)含量測定 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，按試劑盒說明書檢測血清內毒素、二胺氧化酶(DAO)含量測定。

1.6 小腸黏膜HE染色圖片 小腸組織切片后行HE染色，由病理科醫師觀察病理學變化并采用Chiu氏6級評分法行病理評分[7]，光鏡下觀察腸黏膜形態變化。1.7 統計學處理 所有數據均應用SPSS13.0軟件包進行管理和數據統計分析，兩組間計量資料比較采用t檢驗，組內術前術后計量資料比較采用配對t檢驗。P<0.05為有顯著差異。

2 結果

2.1 血膽紅素測定結果 假手術組動物手術前后血清總膽紅素和直接膽紅素差異無統計學意義(P>0.05)。模型對照組和香連丸組動物術后72h血清總膽紅素和直接膽紅素均較手術前顯著升高(P<0.01)，并且與假手術組動物比較也顯著升高(P<0.01)，達到中度黃疸水平(見表1)。

表1 三組術前、后血清總膽紅素水平(±s)對比Tab 1 Serum bilirubin levels before and after surgery in three groups

表1 三組術前、后血清總膽紅素水平(±s)對比Tab 1 Serum bilirubin levels before and after surgery in three groups

注：與假手術組比較，**P<0.01；與手術前比較，##P<0.01。

組別 血清總膽紅素/mmol/L 血清直接膽紅素/mmol/L術前 術后72 h 術前 術后72 h假手術組 2.84±0.80 2.93±0.96 2.13±0.73 2.16±0.85模型對照組 2.89±0.78 24.5±9.59**,## 2.15±0.82 16.73±8.41**,##香連丸組 2.76±0.75 22.5±8.68**,## 2.20±0.93 14.86±8.96**,##

2.2 小腸組織病理學檢查 本實驗使用Chiu氏病理評分法，共有6級：0級為正常小腸黏膜絨毛；1級為在絨毛中軸出現腸黏膜上皮下的Gruenhagen's間隙，常常伴隨毛細血管充血；2級為來自固有膜的腸黏膜上皮抬高以及腸上皮下間隙的擴張，3級為大片腸黏膜上皮抬高，絨毛向兩側倒伏，部分絨毛頂端脫落；4級為絨毛及固有膜脫落，裸露的毛細血管擴張，可看到固有膜細胞成分構成增加：5級為固有膜蛻變或被消化，出血或潰瘍形成。光鏡觀察下(見圖1)，假手術組chiu氏0級15只；模型對照組小腸黏膜chiu氏3級共3只，Chiu氏評分4級共12只；香連丸組小腸黏膜chiu氏1級共1只，chiu氏2級共12只，chiu氏3級共2只。兩組小腸組織病理學分級對比，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 三組小腸組織病理學分級對比Tab 2 Small intestine histopathological grading before and after surgery in three groups

2.3 對兔血中二胺氧化酶(DAO)及血清內毒素的測定及影響 假手術組動物手術前后血清DAO和內毒素水平差異無統計學意義(P>0.05)。模型對照組和香連丸組動物術后血清DAO和內毒素水平均較手術前顯著升高(P<0.01)，但是香連丸組術后血清DAO和內毒素水平均較模型對照組顯著降低(P<0.01)，見表3。

3 討論

梗阻性黃疸對腸黏膜屏障的破環機制極其復雜，它包括阻黃對腸黏膜屏障的機械、細菌、免疫、化學屏障和腸肝軸的破壞，其中又包含腸緊密連接的改變、腸道細胞增生與凋亡的失衡、氧化應激、腸道細菌失調等眾多因素的參與。姚晉林等[8]通過研究發現，梗阻性黃疸時末端回腸黏膜發生萎縮、絨毛水腫和部分上皮細胞脫落，這些改變削弱了腸黏膜的屏障功能，腸道菌群從破損的腸黏膜進入內臟，導致細菌移位的發生，說明腸道細菌移位在梗阻性黃疸病理過程中發揮了重要作用。血二胺氧化酶(DAO)是一種含有脫氨的腐胺和組胺的細胞內酶，可將腐胺氧化為氨基丁醛，并進一步環化成一種吡咯啉，是具有高度活性的細胞內酶。小腸黏膜屏障功能衰竭時，腸黏膜細胞脫落入腸腔，DAO進入腸淋巴管和血流，使血中DAO升高。因此，血中DAO活性可反映腸道損傷和修復情況[9]。內毒素是革蘭陰性菌細胞壁外膜上的一種脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和微量蛋白質的復合物，LPS是它的主要抗原性及致病性部分，在機體免疫力下降等情況下腸道內的致病菌，特別是革蘭陰性菌就會大量生長、繁殖并釋放大量的內毒素，可直接引起腸黏膜屏障損傷[10]。本實驗通過結扎膽總管使兔產生梗阻性黃疸，使兔血清內毒素及血二胺氧化酶較術前明顯上升，達到病理意義，且通過光鏡確認家兔回腸黏膜出現損傷。試驗中香連丸組給予香連丸有效部位灌腸，而對照組給予生理鹽水灌腸，結果香連丸組血二胺氧化酶(DAO)、血清內毒素(ET)的含量較模型組明顯降低(P<0.01)，說明香連丸能有效的保護腸黏膜屏障，這可能與香連丸強效的抑菌作用有關。香連丸有效成分能有效抑制腸內病原菌生長，減少細菌異位的發生可能[11]。此外，香連丸有效部位有抑制腸蠕動、減少腸液、胃酸分泌的作用，從而使本來減弱的腸黏膜屏障得到加固，起到抗炎的作用[12]。

表3 三組術前、后血清DAO及內毒素(±s)的變化Tab 3 The changes of diamine oxidase and endotoxin (±s) before and after surgery in three groups

表3 三組術前、后血清DAO及內毒素(±s)的變化Tab 3 The changes of diamine oxidase and endotoxin (±s) before and after surgery in three groups

注：與假手術組比較，**P<0.01；與手術前比較，##P<0.01。

組別 血清DAO/ku/L 血清內毒素/pg/mL術前 術后 術前 術后假手術組 0.78±0.24 0.83±0.35 0.83±0.31 0.85±0.38模型對照組 0.76±0.34 1.43±0.42**,## 24.60±3.59**,## 130.0±18.9**,##香連丸組 0.79±0.32 1.02±0.37**,##,&& 23.96±4.84**,## 65.5±23.7**,##,&&

圖1 術后各組腸黏膜形態變化Fig 1 Histopathological changes in the three groups after the surgery

綜上所述， 香連丸有效部位對兔梗阻性黃疸腸黏膜損傷有明顯的治療作用，可減輕腸道炎癥反應，對腸黏膜起到保護作用，臨床上可用于對腸炎的治療，但關于其機制還需進一步探討。

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