電針對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠學習記憶功能的影響

林浴坤，陶靜，陳斌，林如輝

認知功能是人類認識和了解客觀事物的能力，由多個認知領域組成，包括記憶、計算、時間定向、空間定向、結構能力、執行能力、語言理解和表達應用等方面。腦卒中后的認知功能障礙發生率達65%[1]，常出現記憶力、空間認知、計算力、推理能力、注意力、定向力等多個認知領域受損。越來越多的證據表明，認知功能障礙影響患者日常生活活動能力以及運動功能的恢復，是制約腦卒中患者全面康復的重要因素[2-3]。約10%～40%的輕度認知障礙患者在1年內可發展為癡呆[4-8]。因此，早期發現并及時干預認知障礙對患者身心功能的全面恢復和預防癡呆有著特別重要的意義。電針療法是傳統治療行之有效的方法之一，可通過多途徑、多靶點、多環節起作用。本實驗采用線栓法制備局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察電針神庭、百會對局灶性腦缺血大鼠學習記憶的影響，以及海馬神經細胞及Bcl-2、Bax mRNA的表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康成年無特殊病原體(SPF)級Sprague-Dawley大鼠45只，體質量(240±20)g。由福建中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(閩)2005-004。大鼠分籠飼養，每籠5只；適應性喂養1周后，用隨機數字表法將大鼠編號，分為假手術組(n=15)、模型組(n=15)和電針組(n=15)。

1.2 主要實驗試劑及儀器

1.2.1 試劑 尼氏染色液：碧云天公司。Trizol：INVITROGEN。cDNA逆轉錄試劑盒及PCR Master Mix：FERMENTAS。Bcl-2、Bax mRNA上下游引物：上海生工公司合成。

1.2.2 儀器 PCR儀：Bio-Rad,Model Gel Doc 2000。水迷宮實驗裝置及動態圖像采集分析系統：中國醫學科學院藥物研究所。YF-7 FB型攤片烤片機：湖北省孝感市亞光醫用電子技術有限公司。華佗牌電子針療儀：蘇州醫療用品廠有限公司。

1.3 動物模型制備

術前所有實驗動物禁食12 h。大鼠稱重，參考Longa方法，行左側大腦中動脈線栓術(MCAO)，制備急性腦梗死動物模型。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉，常規去毛消毒，分離頸總動脈，向上分離出頸內動脈和頸外動脈主干及分支；在頸內、外動脈分叉處結扎頸外動脈，在近心端結扎頸總動脈。用動脈夾夾閉頸內動脈，然后在頸總動脈結扎處遠端約3 mm處剪一小口，將備好的尼龍線經切口導入，從頸外動脈與頸內動脈分叉處插入約18～22 mm，有少許阻力為止。頸部傷口常規縫合。2 h后緩慢退出尼龍線。動物室溫(25℃)環境下蘇醒，正常飲食。實驗過程和動物蘇醒期間注意保暖。

假手術組只分離動脈，不結扎、插線。

動物蘇醒后觀察其體態及行為，不合格的動物剔除。

1.4 干預方法

電針組參考《常用動物腧穴圖譜》取大鼠神庭和百會穴，應用電針刺激，疏密波，頻率1～20 Hz，電壓3～5 V，以針體輕輕抖動為度。每次30 min，每天同一時間治療1次。手術后2 h開始，直至動物被處死。模型組、假手術組置于普通籠中飼養，只給予同等條件抓取，未給予任何治療。

1.5 Morris水迷宮

Morris水迷宮為直徑200 cm、高50 cm的圓形水池，水深30 cm；水溫(25±2)℃；圓形逃逸平臺直徑6 cm，低于水面2 cm，置于某一象限中央。室溫25℃，屋頂和四壁表面光滑整潔，照明設備四周對稱。各組造模后第3天開始檢測。

定位航行試驗歷時4 d。大鼠自由游泳2 min適應環境和人的抓握等相關操作。分別從水池4個象限將大鼠面向池壁放入水中，測其在90 s內尋找到平臺所需的時間(逃避潛伏期)，由計算機記錄各種參數。如果大鼠90 s內未找到平臺，需將其牽引到平臺，停留10 s，這時潛伏期記為90 s。

空間探索試驗：在第7天撤除平臺，記錄大鼠在90 s內穿過平臺所在位置的次數。由計算機記錄各種參數。

1.6 取材及檢測

1.6.1 尼氏染色 各組大鼠行為測試完畢后，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔麻醉，立即開胸暴露心臟，穿刺針從心尖部刺入心臟，調整方向尋找主動脈出口，忌用力穿破心臟；進入主動脈后止血鉗固定針頭。剪開右心耳，快速灌注生理鹽水量約300 ml，4%多聚甲醛(pH=7.4)400 ml灌流固定。取腦，置入4%多聚甲醛內4℃固定24～48 h。定位腦缺血區，常規脫水，石蠟包埋，冠狀切片，片厚5μm。二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，行尼氏染色，嚴格按照說明操作。

1.6.2 RT-PCR 提取左側海馬組織RNA；按照試劑盒說明書操作，將總RNA反轉錄為cDNA。按PCR Master Mix試劑盒說明書進行擴增。引物序列如下。Bcl-2

上游：5′-GGTGGTGGA GGAACTCTTCA-3′

下游：5′-GAGCAGCGTCTTCAGAGA CA-3′Bax

上游：5′-GAGCAGCGTCTTCAGAGA CA-3′

下游：5′-TCA CGGAGGAAGTCCAGT GT-3′β-actin

上游：5′-ACTGGCATTGTGATGGACTC-3′

下游：5′-CAGCACTGTGTT GGCATA GA-3′

擴增體系20μl，其中cDNA模板1μl，上下游引物各0.4 μl，Mix 10 μl，加水8.2 μl。反應條件：95 ℃預變性3 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環。取PCR產物5μl，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色鑒定，凝膠成像。計算圖像軟件分析電泳條帶。

1.7 統計學分析

采用SPSS 18.0統計軟件進行分析。所有數據均滿足方差齊性(P>0.05)，數據以表示，采用ANOVA分析，兩兩比較采用LSD法。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 Morris水迷宮

電針組逃避潛伏期較模型組顯著下降(P<0.001)。見表1。電針組大鼠穿過平臺次數(1.78±0.42)，顯著高于模型組(0.74±0.26)(P=0.001)。見圖1。

2.2 尼氏染色

假手術組尼氏染色清晰均勻，細胞形態完整，細胞核大而圓，核仁清晰，尼氏體染色濃密規則，呈紫藍色。模型組細胞排列松散，細胞體積較小，胞核固縮，尼氏小體減少，細胞溶解，染色呈淡藍染或空染，形態不規則，分布不均。電針組相比模型組尼氏小體較多，染色較均勻，呈藍色，細胞形態相對完整見圖2。

2.3 PCR

模型組大鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA光密度較假手術組降低，Bax mRNA光密度較假手術組升高，Bcl-2/Bax較假手術組顯著降低(P=0.000)；與模型組相比，電針組大鼠海馬組織中Bcl-2 mRNA光密度升高，Bax mRNA光密度降低，Bcl-2/Bax的比值升高(P=0.023)。見圖3。

圖1 各組Morris水迷宮穿過平臺次數比較

圖2 各組腦死區尼氏染色(100×)

圖3 各組腦海馬組織RT-PCR結果

3 討論

中醫理論認為，認知功能與督脈密切相關。認知障礙與中醫“健忘”“失智”“癡呆”等病癥相關，其病位在腦，而與心、肝、脾、腎臟腑功能失調有密切關系；其病機為本虛標實，以精氣虧虛，髓海空虛為本，以痰濁阻竅、瘀阻腦絡為標。督脈與腦及五臟六腑關系密切。臨床相關研究也表明，針灸督脈穴位可促進認知功能的改善[9-10]。

本課題組對督脈穴位進行篩選，表明神庭、百會是古文獻記載也是現在研究較多的穴位，兩穴通常合用，具有開竅醒神、補腎養精的作用。課題組前期研究也表明，電針神庭、百會可改善認知功能[11]。

傳統認為，腦缺血中細胞壞死占主導。近年來研究者發現，細胞凋亡也是腦缺血中神經元死亡的一種主要方式。其中Bcl-2和Bax是Bcl-2家族細胞凋亡過程中重要的調節因子[12-13]。Bax與Bcl-2功能相反，當組織內Bax占優勢，可促進細胞凋亡；當Bcl-2占優勢則抑制細胞凋亡[14]。大鼠局灶性腦缺血存在Bcl-2和Bax的表達，Bcl-2和Bax的比例決定細胞凋亡的趨勢[15]。本研究顯示，模型組海馬組織Bax表達占優勢，致使海馬神經元凋亡，導致認知功能障礙；而電針組可增加Bcl-2表達，降低Bax的表達，從而改善大鼠的學習記憶能力。

認知功能障礙不是一個獨立的臨床表現，由多個領域組成，其中最為基礎的是學習記憶功能。海馬作為人類學習記憶的關鍵部位，也是腦缺血敏感的區域[16]。當海馬組織缺血時，海馬及其周圍神經細胞的凋亡會導致學習記憶下降[17]。

本研究顯示，模型組存在學習記憶功能障礙；而電針干預后，大鼠的學習記憶功能得到改善。這與韓曉華等研究結果一致[18]。

尼氏小體是結構蛋白和分泌蛋白的合成中心，當神經元受到損害時，尼氏小體逐漸解散或消失，神經元的尼氏染色變淡或空染。本研究尼氏染色也觀察到電針可以減少胞核固縮，保護尼氏小體的完整。

綜上所述，電針神庭、百會可改善局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠學習記憶能力，保護神經細胞；作用機制可能包括調節Bcl-2/Bax蛋白表達。

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