穴位注射胞二磷膽堿對腦外傷大鼠生長相關蛋白-43表達的影響

郭知學，李鷗，汪春，馮曉梅

腦外傷(traumatic brain injury,TBI)是常見的嚴重致殘性神經系統傷病。腦外傷后遺癥的功能障礙包括運動障礙、疼痛、感知和認知障礙、精神/心理障礙等[1]。

穴位注射是在傳統的針灸療法基礎上，選擇合適的穴位注入適量的液體藥物，以防治各類疾病的方法。本實驗觀察足三里穴位注射胞二磷膽堿對腦外傷大鼠神經功能及神經生長相關蛋白-43(growth associated protein 43,GAP-43)的影響，以探討穴位注射神經營養劑對腦外傷后神經結構蛋白的合成和促進神經再生與神經功能康復中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體質量250～300 g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(軍)2007-016。注射用胞二磷膽堿鈉：閩東力捷迅公司。兔抗鼠GAP-43單克隆抗體：武漢博士德生物工程有限公司。兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 模型制備及分組

采用改良Feeney法[2]復制自由落體腦損傷模型。大鼠術前禁食8 h，禁水2 h。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯臥固定于腦立體定位儀上。右側顱頂部備皮，常規消毒鋪巾。右側顱頂旁正中切口，長約3 cm，分離皮膚，切開骨膜，向兩側分離，露出約1×1 cm顱骨，皮下少量出血以電凝止血。以前囟后1.5 mm為中心鉆孔，蚊式鉗擴大骨窗至4 mm(注意保護矢狀竇和保持硬腦膜完整)。將其置于自由落體底部，40 g砝碼從25 cm高處滑下，撞擊于骨窗之硬膜上，致傷面積1 cm2，下陷深度約2 mm。假手術組(A組)大鼠8只，麻醉后同樣皮膚切口、暴露骨窗及縫合，但不進行重力撞擊。造模成功大鼠32只用抽簽法分為穴位注藥組(B組)、穴位注水組(C組)、腹腔給藥組(D組)和腹腔注水組(E組)各8只。

1.3 干預方法

胞二磷膽堿粉針以生理鹽水溶解為500 mg/ml。足三里穴定位采用擬人比照法，取大鼠后膝關節外下方腓骨小頭下約5 mm處，直刺5 mm。

B組以500 mg/kg足三里穴位注射，注射體積0.25～0.3 ml；C組足三里穴注射等體積生理鹽水；D組胞二磷膽堿500 mg/kg腹腔注射；E組造模后腹腔注射等體積生理鹽水。A組腹腔注射等體積生理鹽水。

各組注藥、注水均于致傷后30 min開始首次注射，每天1次，連續給藥14 d。各組動物于術后28 d處死。

1.4 觀測指標及方法

1.4.1 大鼠神經功能缺損評分 各組大鼠分別于術前及術后1 d、8 d、14 d參照Bederson的方法[3]進行神經功能缺損評分：提鼠尾離開地面約30 cm，觀察兩前肢狀況；將大鼠置于水平地面，分別從兩側推動其雙肩，觀察兩側抵抗力有無差異；大鼠置于地面，觀察行走情況。采用5級評分法(0～4分)：0分，行為完全正常，步態平穩；1分，提起鼠尾離開地面，非損傷側前肢內旋、內收；2分，將大鼠置于地面，推動大鼠軀體檢查兩側抗力，非損傷側抗力下降；3分，將大鼠置于地面，觀察其行走，只向一側轉圈；4分，無法站立或雖能站立但不能自行行走。

1.4.2 曠場實驗(open-field test) 各組大鼠置于40×80×80 cm的方形曠場中，內壁為黑色，曠場底面分成面積相等的25塊正方形格。正上方2 m處架一攝像機，鏡頭對準箱底。室內隔音，大鼠置于方箱底面中心，同時進行攝像和計時。記錄動物行為，每次測定時間3 min。以穿越底面的格數作為水平積分，以兩前肢同時離地的次數作為垂直積分，兩者之和為曠場試驗積分[4]。于術前及術后15 d、22 d各測1次。

1.4.3 腦組織免疫組化染色 術后28 d各組大鼠4%多聚甲醛300～500 ml心臟灌注，90 min后斷頭，取出全腦，4%多聚甲醛固定4 h。常規脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。損傷區取材切片，片厚10μm，每隔100 μm取1張，每個標本共取6張，取3張行免疫組化染色。

3%H2O2室溫孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶；抗原微波修復；加入兔抗大鼠GAP-43抗體，37℃孵育2 h，PBS漂洗3次；滴加聚合物輔助劑，37℃孵育15 min，PBS沖洗3次；滴加辣根酶標記抗兔IgG多聚體，37℃孵育20 min，PBS漂洗3次；滴加即用型二步法非生物素檢測試劑盒中的試劑2；滴加新鮮配制的DAB溶液顯色5～10 min，蒸餾水洗滌終止染色，蘇木精復染，脫水、透明、封片。陰性對照用PBS代替一抗，同步免疫組化染色處理，結果為陰性。

1.4.4 圖像分析處理 應用IBAS 2000圖像分析系統測定大鼠大腦皮層損傷周圍區的光密度值(OD)。每只大鼠腦切片隨機選取3個高倍視野(400×)，取平均值；同時測定同一張切片上胼胝體OD值作為背景，損傷周圍區OD值減去背景OD值得到校正光密度值(COD)，用于比較分析。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 神經功能缺損評分

術前各組大鼠神經功能缺損評分均為0分。術后，A組神經功能缺損評分均為0分，低于其余各組(P<0.05)。術后1 d造模各組大鼠多為3分：提尾表現為損傷對側前肢內旋或內收，側向擠壓時損傷對側抗力減低，多數可以轉圈行走，少數大鼠無法站立或行走。術后8 d、14 d，造模各組大鼠評分逐漸下降，B組評分低于另外3組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較

2.2 曠場試驗

術前，各組大鼠精神狀態良好，有較高的活動興奮性。A組大鼠在整個實驗過程中處于平穩狀態。術后15 d及22 d，造模各組A組穿越格子數和站立次數減少，曠場試驗評分下降(P<0.05)；B組評分高于另外3組(P<0.05)。見表2。

2.3 GAP-43

GAP-43陽性細胞胞漿著棕黃色，主要分布于損傷區周圍和大腦皮質的神經細胞。B組GAP-43陽性表達明顯多于C組、D組和E組(P<0.05)。見表3。

3 討論

顱腦外傷治療中最重要和最困難的是對認知、情感和行為功能障礙的處理[1]。胞二磷膽堿能夠促進腦組織代謝，改善腦微循環，興奮膽堿能神經，在中樞神經系統損傷后的認知功能恢復等方面有效[5-6]。穴位注射若選擇的經絡、腧穴適當，藥物作用出現時間與效果優于肌肉注射，與靜脈注射效果相當甚至更佳[7]。我們以往的研究顯示，穴位注射胞二磷膽堿對腦外傷大鼠的認知、記憶能力和神經功能均有明顯的改善作用[8-9]。

中樞神經系統損傷后軸突自發再生能力十分有限，因此中樞神經損傷后功能恢復一直是神經科學研究的難點之一。近年來，GAP-43已成為學者研究的焦點，關于GAP-43參與中樞神經損傷修復的研究大量展開。

GAP-43是一種神經元特異性蛋白，主要表達于發育或再生軸突的生長錐末端，參與軸突生長、突觸重構以及兒茶酚胺和神經肽類物質的分泌[10-11]。在腦功能活躍區表達量很高。大量研究證實，GAP-43的表達與成年動物神經元軸突再生及可塑性密切相關[12]。電針刺激足三里穴能夠增加腦梗死大鼠梗死灶GAP-43表達，從而改善腦梗死大鼠神經功能，促進其神經功能重塑[13]。

曠場試驗反映大鼠在新環境中探究行為和適應能力的方法[14]，結合神經功能缺損評分，可以反映大鼠行為功能和認知功能的情況。

大鼠腦損傷后，神經功能明顯障礙，神經功能缺損評分及曠場試驗得分均下降；隨著觀察時間延長，大鼠功能得到一定恢復，穴位注射胞二磷膽堿組功能恢復優于其他各組。

免疫組化染色顯示，造模大鼠在腦損傷后第28天均出現GAP-43表達上調，提示這種蛋白表達在中樞神經系統損傷后重建過程中具有很大潛能；穴位注射胞二磷膽堿可以上調GAP-43蛋白表達，促進腦損傷大鼠神經功能缺損的恢復。

綜上所述，穴位注射神經保護劑療法和GAP-43蛋白表達有望為神經系統損傷等疾病的康復治療開辟一條新的途徑。

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