兔軟骨下骨微損傷模型的建立

劉曉磊，薛祖軍，李曙光，劉克敏

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是骨科常見病，發病率呈上升趨勢，病變主要發生在關節軟骨，但病因及發病機制仍不十分明確。1986年，Radin等首先提出軟骨下骨硬化可能是導致軟骨損傷的重要因素[1]。

目前國內外鮮有軟骨下骨損傷模型的報道，尚無公認的軟骨下骨微損傷的動物模型。我們遵循重物墜落致傷原理設計制造了膝關節打擊器，通過撞擊髕股關節及股骨外側髁，模擬臨床常見膝關節受傷方式，制作兔膝關節軟骨下骨微損傷動物模型，并評價模型的穩定性。

1 材料與方法

1.1 打擊器

由作者自行設計，中國科學院理化技術研究所協助制作。

膝關節打擊器主要由4部分組成：機械架、下肢固定支撐系統、電磁環路系統和重物(圖1)。

機械架包括1個底板、2根立柱系統、1塊矩形橫梁、2根導向桿。橫梁可在50 cm范圍內升降。

下肢膝關節支撐固定系統有支撐、合葉板和軸組成。支撐為“T”形，用以支撐橫軸，使用螺釘固定于系統底板之上；橫軸用以支撐膝關節，固定于支撐上；腿部支板為改良后的合葉結構，穿套于橫軸之上，可實現合葉間夾角的變化和調整。

電磁環路系統由電源盒和電磁吸附裝置組成，電源盒將220 V交流電轉變為24 V直流電，并設保險管及開關。電磁環路系統實現吸附、釋放重物，使重物沿導向桿自由墜落。

重物由重物支架和砝碼組成。重物支架頂部為吸附盤，用以與電磁吸附裝置連接；兩側有導向孔。

圖1 膝關節打擊器

1.2 建模方法

7～9月齡新西蘭大白兔12只，雌性，普通級，體質量2.5～3.8 kg，北京興隆實驗動物養殖場提供，批號SCXK京2007-0003。

取6只兔為A組，其中6個膝關節為實驗組，對側膝關節為對照組。20%烏拉坦750 mg/kg耳緣靜脈麻醉。撞擊前仔細檢查后腿膝關節無異常。將兔仰臥于木質平板上，左膝屈曲120°固定于不銹鋼下肢支撐。1.74 kg重物從30 cm高沿導向桿自由落下，撞擊兔髕股關節；即刻移除重物。撞擊前后分別行X線檢查；撞擊24 h行MRI檢查。

另6只兔為B組，其中6個膝關節為實驗組，對側膝關節為對照組。麻醉方法同上。將兔俯臥于木質平板上，髖關節屈曲外展，膝屈曲90°固定于木質下肢支撐。1.14 kg重物從28 cm高撞擊兔股骨外側髁；即刻移除重物。撞擊前后分別行X線檢查，撞擊后6 d行MRI檢查。

1.3 影像學檢查

1.3.1 X線 撞擊前后兔仰臥位行后腿雙膝關節正側位片，觀察撞擊前膝關節情況及撞擊膝關節有無骨折。

1.3.2 MRI X線未見明顯骨折線者，撞擊后24 h或6 d俯臥位將雙膝關節伸直位固定于寬5 cm硬紙板上，采用SIGNA Twinspeed 1.5 T型MRI(美國通用公司)行以下序列檢查：①矢狀、冠狀、軸位T1加權像，TR/TE 400/14.3，矩陣384×224，S/I；②矢狀、冠狀、軸位 T2加權像，TR/TE 3000/102，矩陣 384×224，S/I；③矢狀、冠狀、軸位T2壓脂像，TR/TE 3000/102，矩陣384×224，S/I。

所有序列均使用頸線圈，層厚3 mm，無間隔。

X線、MRI結果由兩名具有豐富經驗的高年資放射科醫生分析。

1.4 組織學觀察

MRI檢查后，兔空氣栓塞處死，立即解剖，取股骨髁置于4%多聚甲醛中固定3 d，甲酸脫鈣2周，石蠟包埋。股骨股骨髁部和髕面作5μm矢狀連續切片，HE染色。

2 結果

2.1 一般情況

所有12只試驗動物無脫失，全部進入分析。

實驗組均未出現重物反彈和二次撞擊。A組1只撞擊后出現髕骨脫位。撞擊后，兔活動頻次減少。所有撞擊側膝關節均可見腫脹，對照側膝關節正常。

2.2 影像學檢查

雙膝關節正側位片示所有12只兔髕骨、股骨均未見明顯骨折線。

MRI示A組實驗組膝關節髕上囊和腘窩處均可見大量長T1、長T2信號，冠狀位可見股骨干骺端T1加權像低信號、T2加權像和脂肪抑制像低信號。對照組均未見異常影像。

B組1只兔膝關節MRI圖像質量較差(該兔大腿外側可見T1加權像低信號、T2加權像和脂肪抑制像高信號)，余5只兔實驗組5個膝關節矢狀位T2脂肪抑制像可見股骨以遠骺端長T2壓脂密度信號，邊界不清，密度不均勻，占骺端1/3；T2加權像可見相同層面、相同位置略長T2信號，異常信號范圍小于T2脂肪抑制像；T1加權像可見相同層面、相同位置略長T1信號，異常信號范圍與T2加權像相當。軸位T2脂肪抑制像可見股骨外側髁長T2壓脂密度信號，其中伴有短T2信號，占股骨外側髁大部分；T2加權像可見股骨外側髁相同層面、相同位置略長T2混雜信號，占股骨外側髁大部分；T1加權像可見股骨外側髁相同層面、相同位置略長T1信號，其間混雜斑點狀、網狀信號(圖2)。對照組未見異常影像。

2.3 HE染色

實驗組軟骨基質著色均勻，軟骨細胞分層清晰；表層軟骨細胞呈梭形，近似水平排列，中間層呈散在無序排列，柱狀層呈柱狀排列；軟骨細胞未見形態大小和排列異常，潮線完整；軟骨下骨皮質完整；骨小梁呈拱形，局部排列紊亂(B組)或連續性中斷(A組)；髓腔內可見多處不規則排列大片紅細胞(圖3)。

對照組軟骨基質成粉紅色，著色均勻；軟骨細胞核呈深藍色，胞漿呈粉紅色；表層軟骨細胞呈梭形，近似水平排列，中間層呈散在無序排列，柱狀層呈柱狀排列，其下方為潮線；鈣化軟骨層細胞較大，其下方為軟骨下骨皮質和骨小梁。軟骨下骨區血管豐富，骨小梁呈拱形，排列規則；髓腔內可見規則排列的紅細胞。

圖2 B組實驗組MRI

圖3 HE染色

3 討論

Radin等[2]和Thompson等[3]分別建立慢性反復和急性單次撞擊骨關節炎模型時發現，軟骨下骨損傷可能是引起骨關節炎主要原因。2005年，Lahm等建立狗髕股關節軟骨下骨損傷模型[4]。以上3種模型均是撞擊髕股關節，而臨床膝關節軟骨下骨微損傷形式多樣，損傷機制十分復雜，單一動物模型僅能反映一種損傷，不能滿足臨床軟骨下骨微損傷的各個方面需求。

比較理想的軟骨下骨微損傷模型應具備以下幾個條件：①閉合傷，具有良好的臨床相關性；②病理變化的一致性；③可控性和可重復性。

膝關節打擊器采用重物從不同高處下落撞擊致傷，與Haut[5]和Li[6]方法一致；通過電磁環路系統實現吸附、釋放撞擊重物，確保重物方向一致性；下肢膝關節支撐固定系統采用合頁設計，實現屈曲角度的可調性；外固定小腿、大腿和骨盆，操作簡單方便。

本研究通過撞擊髕股關節和股骨外側髁兩種方法制作軟骨下骨微損傷模型，實驗組均未出現重物反彈和二次撞擊。組織病理學觀察顯示軟骨未受影響，軟骨下骨微損傷；建立的模型具有一致性、可重復性。

軟骨下骨微損傷，即骨挫傷，主要病理表現為骨髓出血、水腫，伴或不伴松質骨微骨折[7-8]。MRI表現為T1加權像低信號，與高信號的正常骨髓信號對比明顯；T2加權像高信號；壓脂像高信號，與信號被抑制的鄰近正常骨髓形成鮮明對比[9-11]。

Escalas等建立兔骨挫傷模型，于傷后1、3、9周行MRI檢查，所有實驗動物均出現T1加權像低信號和T2加權像高信號，組織病理學僅見骨髓水腫和正常細胞的移位[11]。Ryu等對14個豬脛骨近端干骺端骨挫傷區組織病理學和傷后當天MRI檢查發現，組織病理學顯示骨髓水腫出血者，其T1加權像表現為低信號、線性低信號和未見異常信號，T2加權像表現為高信號、低信號和未見異常信號；嚴重出血區表現為T1、T2加權像和T2壓脂像均為低信號；出血水腫混合區表現為彌漫性低信號[12]。

本研究A組傷后24 h股骨髁干骺端出現T1加權像、T2加權像低信號和T2脂肪抑制序列低信號，組織病理學顯示骨小梁呈拱形，局部排列紊亂或連續性中斷，髓腔內可見多處不規則排列大片紅細胞。與Ryu等研究的較重損傷病理結果一致[12]。B組傷后3 d行MRI檢查，所有序列均未見異常信號；傷后6 d MRI表現為T1加權像低信號、T2加權像及T2壓脂像高信號。與文獻描述結果一致[11-12]。不同程度損傷MRI表現各不相同，較輕的損傷引起骨髓水腫，MRI表現為T1加權像低信號和T2加權像高信號；若外力增加，損傷加重，則會導致骨梁骨折、微骨折和出血，MRI表現為T1、T2加權像和T2壓脂像均為低信號或彌漫性低信號。

Blankenbaker等報道一名髖關節半脫位運動員，傷后2 h行MRI檢查未見異常信號，3個月后復查發現股骨頭前上出現骨水腫信號[13]。他們建立豬髕股關節骨挫傷模型，并于傷后1、6、12和30 h分別行MRI檢查，結果顯示創傷后MRI出現骨挫傷表現最早在傷后1 h，也可延遲至傷后30 h[13]。

本研究以股骨髁為研究對象，發現創傷后1 d和3 d，MRI均未見異常信號；傷后6 d出現明顯骨挫傷表現，較30 h[13]落后，可能與創傷較重致出血有關。以上結果提示，臨床若MRI早期檢查陰性，但患者存在持續疼痛和活動受限，應在傷后5～7 d復查。

膝關節股骨髁處骨髓腔內含有豐富的骨髓，髓腔內脂肪在MRI表現為短T1加權和中長T2加權信號。外力作用使骨髓局部水腫、充血，表現為明顯的長T1、長T2信號，常規T1加權和T2加權可以顯示骨損傷[14]；若將脂肪信號去除，則可更清晰有效地顯示出血水腫信號。脂肪抑制序列[10]通過抑制骨髓腔內脂肪信號來顯示骨髓水腫、充血等含水豐富組織的信號，是診斷軟骨下骨損傷最為有效的影像檢查手段[15]。本研究顯示，T2脂肪抑制序列顯示病變范圍較T1加權和T2加權檢出范圍大，邊界也更加清晰。

國外有研究采用不同方法撞擊髕股關節[3-4]。國內對軟骨下骨微損傷的臨床研究較少，更缺乏相應的動物實驗研究，中文文獻檢索未發現有關軟骨下骨微損傷的動物實驗研究。本研究采用撞擊股骨外側髁方式，既避免了撞擊髕股關節力量經髕骨傳至股骨和腘窩處軟組織緩沖等不確定因素，又模擬了臨床常見的膝關節致傷機制，具有良好的臨床相關性。

進一步研究應改進下肢固定裝置，確保打擊部位一致和受到撞擊時最小移動；改進并實現致傷加速度可變、可控，以期得到更多可監控、分析的相關信息，充分模擬臨床上不局限于重力加速度的損傷方式；進一步驗證其信度和效度。

[1]Radin EL,Rose RM.Role of subchondral bonein the initiation and progression of cartilage damage[J].Clin Orthop Relat Res,1986,(213):34-40.

[2]Radin EL,Parker HG,Pugh JW,et al.Response of jointsto impact loading-III relationgship between trabecular microfractures and cartilage degeneration[J].JBiomrchnics,1973,6(1):51-57.

[3]Thompson RC Jr,Oegema TR Jr,Lewis JL,et al.Osteoarthrotic changes after acute transarticular load.An animal model[J].J Bone Joint Surg Am,1991,73(7):990-1001.

[4]Lahm A,Uhl M,Edlich M,et al.An experimental caninemodel for subchondral lesionsof thekneejoint[J].Knee,2005,12(1):51-55.

[5]Haut RC,Ide TM,De Camp CE.Mechanical responses of the rabbit patello-femoral joint to blunt impact[J].JBiomech Eng,1995,117(4):402-408.

[6]Li XW,Haut RC,Altiero NJ.An analytical model to study blunt impact response of the rabbit P-F joint[J].J Biomech Eng,1995,117(4):485-491.

[7]Rangger C,Kathrein A,Freund MC,et al.Bone bruise of the knee:histology and cryosections in 5 cases[J].Acta Orthop Scand,1998,69(3):291-294.

[8]Roemer FW,Frobell R,Hunter DJ,et al.MRI-detected subchondral bone marrow signal alterations of the knee joint:terminology,imaging appearance,relevance and radiological differential diagnosis[J].Osteoarthritis Cartilage,2009,17(9):1115-1131.

[9]Yao L,Lee JK.Occult intraosseous fracture:Detection with MR imaging[J].Radiology,1988,167(3):749-751.

[10]Xu L,Hayashi D,Roemer FW,et al.Magnetic resonance imaging of subchondral bone marrow lesions in association with osteoarthritis[J].Semin Arthritis Rheum,2012,42(2):105-118.

[11]Escalas F,Curell R.Occult posttraumatic bone injury[J].Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc,1994,2(3):147-149.

[12]Ryu KN,Jin W,Ko YT,et al.Bonebruises:MRcharacteristicsand histological correlation in the young pig[J].J Clin Imag,2000,24(6):371-380.

[13]Blankenbaker DG,De Smet AA,Vanderby R,et al.MRIof acute bone bruises:timing of theappearanceof findings in a swine model[J].Am J Roentgenol,2008,190(1):W1-W7.

[14]U?ar BY,Necmio?lu S,Bulut M,et al.Determining bone bruises of the knee with magnetic resonance imaging[J].Open Orthop J,2012,6:464-467.

[15]Hayashi D,Guemazi A,Kwoh CK,et al.Semiquantitative assessment of subchondral bone marrow edema-like lesions and subchondral cysts of the knee at 3T MRI:A comparison between ntermediate-weighted fat-suppressed spin echo and Dual Echo Steady State sequences[J].BMCMusculoskelet Disord,2011,12:198.