T細胞亞群偏移與雌激素缺乏骨丟失相關性實驗研究①

高秀蓮 邢美云 王 麗 郭鈺琪 周憲賓 張巧鳳 張洪海 姚成芳 姜國勝 李 霞

(山東省醫學科學院基礎醫學研究所腫瘤免疫與中藥免疫重點實驗室，濟南 250062)

正常骨代謝是成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨丟失之間的平衡過程，骨代謝失衡將導致骨疾病的發生［1］。已證實雌激素參與了骨代謝過程，雌激素缺乏狀態下骨丟失加速，易導致骨質疏松、骨折等骨代謝性疾病，嚴重影響患者健康，但其發病機理尚未完全闡明。目前治療主要采用雌激素替代療法，取得一定療效，但存在誘發子宮內膜癌、宮頸癌、乳腺癌、代謝紊亂等危險，因此臨床亟待開發防治雌激素缺乏骨丟失療效確切且副作用小的藥物與方法。隨著系統醫學研究不斷深入，證實機體骨代謝系統與內分泌系統、免疫系統之間存在著密切聯系，三者形成內分泌-免疫-骨代謝調節網絡，在骨代謝過程發揮著復雜而精細的調控作用［2］。T細胞是免疫調節的主體，Th17、Treg亞群的發現使經典的Th1/Th2模式擴展為Th1/Th2/Th17/Treg模式［3］。不同T細胞亞群產生特異性細胞因子，在機體抵抗病原體感染、維持機體免疫內環境穩定中發揮著重要作用，其亞群失衡參與了多種自身性免疫疾病及代謝性疾病的發生，但其在雌激素缺乏骨丟失中的作用尚未明確［4］。本研究通過建立雌激素缺乏骨丟失小鼠動物模型，觀察雌激素缺乏狀態下Th1/Th2/Th17/Treg亞群偏移狀態，探討其與雌激素缺乏骨丟失的相關性，以期進一步揭示雌激素缺乏骨丟失的發病機制，為臨床治療提供新的靶點與途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雌性BALB/c小鼠，由北京維通利華有限公司提供，鼠齡10周，體重(22±2)g，置于室溫24℃，相對濕度60%～65%的超凈動物飼養柜內，給予12 h光照，12 h暗室，自由飲水攝食。

1.2 主要試劑 大鼠抗小鼠熒光抗體:PC5-CD25、FITC-CD4、PE-TNFα、PE-IL-4、PE-IL-17A、PE-Foxp3均購自美國BD Pharmigen公司;雌二醇ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 30只BALB/c小鼠隨機分為正常組、假手術組及卵巢切除組，各10只。

1.3.2 動物處理 小鼠禁食12～18 h，10%水合氯醛注射液按100 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，卵巢切除經腹腔行常規手術切除雙側卵巢，假手術組不切除卵巢，僅切除卵巢周圍與卵巢等大的脂肪組織。術后自由進食水，12周后進行指標檢測。

1.3.3 標本收集 末次給藥后1 h小鼠眼球取血，頸椎脫臼處死，分離血清，ELISA法檢測E2水平;無菌分離脾臟，200目銅網研磨過濾，冷PBS沖洗，Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞，用于流式胞內外因子雙染色檢測;取右側股骨，剔除軟組織，用于BMD檢測。

1.3.4 ELISA法檢測血清E2水平 按ELISA試劑盒操作說明測定血清E2。

1.3.5 骨密度測定 雙能X射線骨密度儀測量小鼠股骨前后位BMD。

1.3.6 流式抗體標記與檢測 收集脾臟單個核細胞(1×106/管)，加入大鼠血清，室溫避光孵育30 min。將外標抗體(FITC-CD4、PC5-CD25)按說明書分別加入到細胞懸液中，4℃避光孵育30 min。冷1×PBS 洗2次;去上清，加入100 μl固定液，4℃避光孵育30 min。冷1×PBS洗1次，加入100 μl穿膜液重懸細胞，將內標抗體(PE-TNFα、PE-IL-4、PEIL-17A、PE-Foxp3)加入細胞懸液中，4℃避光孵育12 h。加入1 ml穿膜液洗1次，去上清，冷1×PBS洗2次，1×PBS重懸細胞，轉管，上機檢測。采用Winmidi 2.9分析Th1亞群(CD4+TNFα+)、Th2亞群(CD4+IL-4+)、Th17亞群(CD4+IL-17A+)及Treg亞群(CD4+CD25+Foxp3+)比例。

1.4 統計學處理 應用SPSS11.5軟件分析，計量資料以表示，采用One Way-ANOVA方差分析，數據間相關性用Pearson相關性分析，相關系數(r值)為正，表示正相關，r值為負，表示負相關，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清E2水平比較 與正常組及假手術組比較，卵巢切除組小鼠E2水平顯著降低(P＜0.05)，證實雌激素缺乏小鼠模型建立成功，見圖1。

2.2 各組小鼠骨密度比較 與正常組及假手術組比較，卵巢切除組小鼠股骨骨密度顯著降低(P＜0.05);假手術組與正常組小鼠比較，股骨骨密度無顯著性差異;證實雌激素缺乏狀態導致骨丟失，見圖2。

2.3 各組小鼠Th1/Th2亞群比例變化 與正常組及假手術組比較，卵巢切除組小鼠脾臟單個核細胞Th1亞群比例顯著升高(P＜0.05)，Th2亞群比例顯著降低(P＜0.05)，Th1/Th2比值明顯升高(P＜0.05)，提示雌激素缺乏骨丟失狀態存在Th1/Th2亞群向Th1偏移現象，見圖3。

2.4 各組小鼠Th17/Treg亞群比例變化 與正常組及假手術組比較，卵巢切除組小鼠脾臟單個核細胞Th17亞群比例顯著升高(P＜0.05)，Treg亞群比例顯著降低(P＜0.05)，Th17/Treg比值明顯升高(P＜0.05)，提示雌激素缺乏骨丟失狀態存在Th17/Treg亞群向Th17偏移現象，見圖4。

圖2 股骨骨密度比較Fig.2 Comparison of BMD of thigh bone

圖3 Th1/Th2亞群比例變化Fig.3 Paradigm of Th1/Th2 subsets

2.5 E2、骨密度、T細胞亞群相關性分析 相關性分析顯示E2水平與骨密度、Th2亞群比例、Treg亞群比例呈顯著正相關(P＜0.05)，與Th1亞群比例、Th17亞群比例呈顯著負相關(P＜0.05);骨密度與Th1、Th17亞群比例呈顯著負相關(P＜0.05)，與Th2、Treg亞群比例呈顯著正相關(P＜0.05)，見表1。相關性結果提示T細胞亞群在維持正常骨代謝過程中發揮著重要作用，雌激素缺乏導致的T細胞亞群失衡狀態可能在骨丟失中扮演了重要角色，靶向逆轉T細胞亞群失衡的方法可能成為減輕雌激素缺乏骨丟失的有效途徑。

圖4 Th17/Treg亞群比例變化Fig.4 Paradigm of Th17/Treg subsets

表1 E2、骨密度、T細胞亞群比例相關性Tab.1 Correlation analysis of E2，BMD and paradigm of T-cell subsets

3 討論

雌激素缺乏導致的骨質疏松癥等骨代謝疾病嚴重危害患者健康，給家庭、社會帶來沉重負擔，成為世界范圍內日益受到關注的健康問題。目前西醫治療雌激素缺乏骨丟失相關疾病主要采用雌激素替代療法，但存在誘發子宮內膜癌、宮頸癌、乳腺癌風險及代謝紊亂等副反應。因此，進一步闡釋雌激素缺乏導致骨丟失的機制，將為尋找預防或治療雌激素缺乏骨丟失療效確切、副作用小的方法與藥物提供科學依據。

隨著系統研究的不斷深入，證實內分泌系統、免疫系統和骨代謝系統間存在密切聯系，三個系統間共享多種調控分子，包括細胞因子、轉錄因子、受體及信號分子等，一個系統的生理病理狀態不可避免地影響另一個系統［5］。雌激素是重要的性激素，T細胞是機體免疫系統中重要的細胞群體，雌激素-T細胞-骨代謝三者的關系成為目前本領域研究的熱點。已證實T細胞上存在雌激素受體，雌激素水平變化可直接影響T細胞增殖、活化和亞群極化，雌激素缺乏可誘導T細胞向Th1漂移，導致T細胞亞群極化失衡［6］。正常小鼠去卵巢后發生骨質疏松，而裸鼠去卵巢后骨量并未丟失，提示雌激素誘導的T細胞亞群極化狀態對骨代謝有重要調節作用［7］，但雌激素缺乏對T細胞亞群(Th1/Th2/Treg/Th17)極化的影響在雌激素缺乏導致的骨丟失中究竟發揮著怎樣的作用尚缺乏系統研究。

初始T細胞遇抗原刺激后在特異性核轉錄因子與分化誘導因子作用下，分化為Th1/Th2/Th17/Treg等亞群，分泌特征性細胞因子，主導不同的免疫反應。Th1、Th2是經典的 T細胞亞群，Th1/Th2亞群平衡在維持正常骨代謝中具有重要作用。Th1亞群產生TNFα等促骨吸收因子，能誘導破骨細胞形成，促進骨吸收作用［8］。Th2類細胞因子產生IL-4等細胞因子，抑制 NF-κB的受體活化配基(RANKL)誘導的生理性骨吸收和TNFα誘導的破骨細胞生成與成熟，進而抑制骨吸收，減少骨丟失［9］。Th17和Treg產生于同一前體細胞，分化過程受多種相同誘導因子及轉錄因子調控，Th17/Treg亞群平衡在維持正常骨代謝中發揮著重要作用［10］。Th17通過產生IL-17A等細胞因子介導炎癥反應，在機體防御病原微生物感染中發揮重要作用，但其過度表達則可造成機體組織損傷［11］。有研究報道雌激素缺乏狀態能誘導分泌IL-17的Th17亞群，進而促進破骨細胞活化，提示Th17在雌激素缺乏導致的骨丟失中扮演了重要角色［12］。Treg高表達CD25，Foxp3是其特異性核轉錄因子，Treg通過產生TGF-β等細胞因子或通過細胞間直接接觸發揮免疫抑制與調節作用，能夠通過抑制破骨細胞功能減少骨丟失［13］。

我們的前期研究發現，雌激素缺乏導致的骨丟失狀態存在著Th1類細胞因子TNFα表達升高［14］，提示T細胞亞群偏移可能參與了雌激素缺乏骨丟失的過程。本研究發現，去卵巢小鼠雌激素水平顯著降低，同時骨密度顯著下降，E2水平與骨密度呈顯著正相關，證實雌激素缺乏狀態導致骨丟失。同時，我們發現，雌激素缺乏狀態下，Th1、Th17亞群比例顯著升高，Th2、Treg亞群比例顯著降低，T細胞平衡向Th1、Th17亞群偏移。相關性分析顯示E2水平及骨密度均與Th1、Th17亞群比例呈顯著負相關，與Th2、Treg亞群比例呈顯著正相關，提示雌激素缺乏誘導的T細胞亞群失衡參與了骨丟失過程，靶向逆轉T細胞亞群失衡的方法可能成為減輕雌激素缺乏骨丟失的有效途徑。本研究進一步闡釋了雌激素缺乏骨丟失的發病機制，為靶向逆轉雌激素缺乏導致的T細胞亞群失衡狀態減輕骨丟失提供了實驗依據，但雌激素缺乏狀態T亞群分化失衡影響破骨細胞與成骨細胞分化與功能的確切分子機制仍需進一步深入探討。

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