mIL-21-hIgGFc融合蛋白在293E細胞中的表達純化及其對CD8+T細胞表型的影響①

黃啟彬 劉明月 符少月 邢 巧 劉瀟淇 王盛典 易發平

(重慶醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室分子醫學與腫瘤研究中心，重慶 400016)

細胞因子白細胞介素21(Interleukins 21，IL-21)主要由CD4+T細胞中的Th17和NKT細胞分泌［1］。小鼠IL-21基因位于3號染色體，緊鄰IL-2基因。成熟的小鼠 IL-21帶有122個氨基酸殘基［2］。IL-21可促進抗CD3抗體活化的胸腺細胞、成熟外周血T細胞的增殖，或者在無抗CD3抗體的刺激下，與IL-2、IL-15、IL-7協同作用促進外周血T細胞增加［3］。在缺乏抗CD3或其他共刺激因子情況下，IL-21對T細胞的增殖則沒有顯著的作用。原始CD8+T細胞低表達IL-21R，IL-21并不能單獨誘導其增殖，而與IL-15或IL-7協同后就能誘導原始CD8+T細胞和記憶CD8+T細胞增殖［4］。然而，IL-21是否能夠影響 T細胞的其他功能，尤其是對CD8+T細胞的直接作用尚未明確。

本實驗通過重組表達小鼠白細胞介素21(mIL-21)和人hIgGFc片段，刺激P1A小鼠CD8+T細胞，探討其對CD8+T細胞的作用，為后續研究IL-21的作用機制及其在腫瘤免疫方面的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞及質粒 人胚腎細胞株293E細胞、大腸埃希菌DH5α、質粒PTT3-hIgGFc都由中國科學院生物物理研究所提供。

1.2 主要試劑 質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，高保真TaqDNA聚合酶、限制性內切酶PmeⅠ和XbaⅠ、逆轉錄試劑盒購自NEB公司，2×PCR mixture購自北京全式金生物技術有限公司，RPMI1640、DMEM培養基及胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，Trizol試劑購自 Invitrogen公司，IL-2、IL-21 ELISA試劑盒購自eBioscience公司，SDS-PAGE相關試劑購自Biorad公司;其他試劑均為國產分析純。BALB/c小鼠，6～8周、體重18～20 g以及P1A小鼠由中國科學院生物物理研究所提供。

1.3 細胞培養 293E細胞用10%FBS、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養。

1.4 脾臟淋巴細胞的分離 取BALB/c小鼠脾臟于RPMI1640完全培養基中。玻片磨砂端輕輕研磨，使細胞分散。收集細胞，100 μm篩網過濾，1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入1 ml紅細胞裂解液，2 min后加入培養基終止裂解反應。1 500 r/min離心5 min，收集脾臟淋巴細胞。

1.5 小鼠IL-21基因的擴增 根據GenBank中登錄的小鼠IL-21基因序列(NC_000962.2)設計引物，上游引物:5'-ATCGGTTTAAACGGAGACTCAGTTCTG-3'(下劃線為PmeⅠ酶切位點)，下游引物:5'-R:AGCTTCTAGAGGAGAAGTGCTGATGAATC-3'(下劃線為XbaⅠ酶切位點)，擴增片段大小為480 bp。用Trizol試劑從小鼠脾臟淋巴細胞提取總RNA，逆轉錄得到cDNA，擴增出IL-21全長序列。反應體系為50 μl:10 ×PCR Buffer(含 Mg2+)5.0 μl，dNTP Mixture(2.5 mol/L)4 μl，cDNA 1.0 μl，上下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μl，高保真 Taq DNA 聚合酶 0.5 μl，ddH2O 38.5 μl。反應條件為:94℃ 3 min;94 ℃30 s，55 ℃40 s，72℃ 1 min，30次循環后72℃ 10 min。PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.6 目的基因克隆及重組質粒表達的大量擴增用膠回收試劑盒回收目的片段，限制性內切酶PmeⅠ和XbaⅠ定向克隆到PTT3-hIgGFc載體，T4連接酶16℃連接過夜。連接產物轉化感受態DH5α，涂LB平板14 h后，挑取單克隆。提取質粒，雙酶切PmeⅠ和XbaⅠ鑒定，并送上海生工進行測序。將測序正確的重組表達載體 PTT3-mIL-21-hFc轉化DH5α菌株，挑取單菌落，接種于5 ml LB培養基(含30 μg/ml氨芐青霉素)，37℃振蕩培養過夜。取過夜培養物，按1∶100比例接種于500 ml LB培養基(含 30 μg/ml氨芐青霉素)中，培養至菌液A600=0.6～1.0后，按照天根質粒大提試劑盒提取質粒。

1.7 融合蛋白mIL-21-hIgGFc的表達和純化 當293E細胞在10 cm培養皿的密度達到80%后，磷酸鈣法轉染PTT3-mIL-21-hIgGFc質粒。12 h后，加入15 ml(37℃預熱)DMEM培養基(含0.5%FBS)，48 h后收上清。重新加入10 ml DMEM培養基繼續培養，24 h后收上清。將收集的500 ml上清，4 000 r/min，4℃離心5 min除去死細胞和細胞碎片，再用0.22 μm濾膜過濾除去更小一些的顆粒物，得到培養上清，經MOLLIPORE LabscaleTMTFF system(5 kD濾膜)濃縮至20 ml，加到預處理的Protein G瓊脂糖柱，流速1 ml/min，重復上樣兩遍。10倍柱體積binding buffer洗柱，除去雜蛋白;10倍柱體積elution buffer洗脫，收集洗脫液。截留分子量10 000的MILLIPORE超濾管濃縮至1 ml。0.22 μm濾膜過濾、分裝凍存于－80℃，備用。

1.8 融合蛋白mIL-21-hIgGFc檢測 eBioscience公司ELISA試劑盒檢測融合蛋白mIL-21-hIgGFc濃度，具體步驟參照說明書。酶標儀450 nm處測定OD值，繪制標準曲線，計算融合蛋白mIL21-hIgGFc濃度。同時10%SDS-PAGE凝膠電泳分析監測整個生產純化融合蛋白的過程，以確定得到的融合蛋白的純度和質量。

1.9 融合蛋白mIL-21-hIgGFc對CD8+T細胞表型的影響 處死P1A小鼠，取出脾臟、雙側腋下和腹股溝4個淋巴結，玻片研磨成勻漿，100 μm篩網過濾，得到細胞懸液。紅細胞裂解液去除紅細胞，1 500 r/min，離心10 min，收集淋巴細胞。1 ml MACS buffer重懸細胞并計數。加入抗體CD8-FITC，4℃孵育20 min。20 ml MACS buffer 4℃終止抗體孵育，1 500 r/min，離心10 min。棄上清，900 μl MACS buffer重懸細胞，加入100 μl Anti-FITC 微珠，4～8℃孵育20 min，離心收集細胞。1 ml MACS buffer重懸，分離柱過濾，收集CD8+T細胞。同時用免疫磁珠陽選淋巴細胞中的CD11C+細胞，加入1 μg/ml P1A抗原肽，置于細胞培養箱培養兩個小時后，離心收集CD11C+細胞。將CD8+T細胞和CD11C+細胞按1∶10混合后，以5×105/孔接種于96孔板，分別用100 ng/ml融合蛋白mIL-21-hIgGFc和小鼠白細胞介素2(IL-2)刺激72 h后，檢測CD44、CD62L表達情況。

2 結果

2.1 mIL-21基因擴增產物的鑒定 mIL-21基因PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約400～500 bp的特異性條帶，大小與預期一致，如圖1。

2.2 重組質粒的酶切鑒定 PmeⅠ和XbaⅠ進行雙酶切鑒定重組質粒，理論上酶切產物小片段大小為463 bp。電泳結果與預期相符，如圖2。將酶切鑒定正確的質粒進行測序分析，結果顯示目的基因與IL-21基因序列完全一致。這些結果表明，構建的質粒PTT3-IL21-hIgGFc完全正確。

圖1 mIL-21基因PCR產物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of mIL-21 gene

2.3 融合蛋白mIL21-hIgGFc的表達量 ELISA檢測結果表明，PTT3-mIL-21-hIgGFc轉染293E細胞可檢測mIL21-hIgGFc蛋白的表達，而在沒有轉染的293E上清中不能檢測到mIL21-hIgGFc。經計算，上清中的融合蛋白濃度為787 ng/ml。純化后一共得到約0.5 mg融合蛋白 mIL21-hIgGFc。SDS-PAGE分析顯示，細胞培養液上清經HiTrapTMProtein G柱純化后，獲得蛋白純度高，雜蛋白較少，如圖3。

2.4 融合蛋白mIL-21-hIgGFc對CD8+T細胞的影響 如圖4所示，融合蛋白mIL-21-hIgGFc可以誘導產生更多的CD44lowCD62LhiCD8+T細胞，而白細胞介素2(IL-2)和陰性對照組不具有這樣的功能。CD44lowCD62LhiCD8+T細胞同其他亞型的CD8+T細胞，具有更好的記憶功能，在腫瘤的過繼免疫治療中可能會發揮重要作用。

圖2 重組質粒PTT3-mIL-21-hIgGFc的雙酶切(PmeⅠ和XBalⅠ)鑒定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid PTT3-mIL-21-hIgGFc(PmeⅠ/XBalⅠ)

圖3 純化mIL-21-FCFc蛋白SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profiles of purified mIL-21-hIgGFc

圖4 流式細胞術檢測mIL21-hIgGFc對CD8+T表型的影響Fig.4 Phenotypic effects of mIL21-hIgGFc on CD8+T by flow cytometry

3 討論

在有抗原刺激時，IL-21R在B細胞和T細胞上的表達均增加。在T細胞中，TCR誘導的IL-21R表達增加主要是由于TCR介導的Sp1蛋白增加及其脫磷酸化作用［5］。IL-21 與 IL-2、IL-4、IL-7 和 IL-15一樣，是γ鏈細胞因子家族的一員，可以通過與其受體IL-21R的結合作用于多種細胞。IL-21與其受體結合后能啟動下游信號，最終活化STAT3、STAT1和STAT5，在免疫細胞的發育、增殖、活化和遷移過程中發揮重要功能［6］。IL-21能調節淋巴細胞的發生發展，在炎癥反應、變態反應和自身免疫中都起著舉足輕重的作用。研究人員在不同模型中證明了IL-21的抗腫瘤作用，其機制主要在于NK細胞和CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫反應，以及減少調節性T細胞的數量［7-9］。臨床實驗也已經表明，IL-21具有較好的治療腫瘤的效果。

在腫瘤的免疫治療方面，過繼免疫治療越來越引起人們的重視。過繼細胞治療(Adoptive cell therapy，ACT)指自體免疫細胞進行體外激活和擴增至一定數量后回輸至腫瘤患者體內，在體內發揮殺傷腫瘤細胞作用的治療方法［10］。從腫瘤組織中分離出的CD4+、CD8+T細胞，在體外經白介素(Interleukin，IL)的刺激、活化、擴增后可應用于臨床腫瘤過繼細胞治療。CD8+記憶T細胞可能會取代傳統的細胞毒性 T細胞(Cytotoxic lymphocyte，CTL)，成為過繼免疫治療(Adoptive immunotherapy)細胞，它們將會發揮持久而強大的治療作用［11］。Hinrichs等［12］發現，IL-21和IL-2對CD8+T細胞有對立的分化作用，即IL-21抑制了抗原誘導的初始CD8+T細胞向效應性CD8+T細胞的活化，同時誘導CD8+T細胞表達淋巴細胞歸巢受體，從而在腫瘤的過繼免疫治療中發揮更好的作用，進一步研究表明，記憶性CD8+前體 T細胞的功能成熟依賴 IL-10-IL-21-STAT3 信號通路［13］。

本實驗構建了重組質粒PTT3-mIL-21-hIgGFc，轉染293E細胞，收集培養液上清，濃縮純化獲得mIL-21-hIgGFc融合蛋白。用該蛋白處理陽選的P1A小鼠CD8+T細胞，同時陽選出CD11C+細胞(預先給予抗原肽刺激)，共培養72 h后，流式細胞術檢測發現，mIL-21-hIgGFc融合蛋白可以增加CD8+T細胞中CD44lowCD62Lhi的比例，而CD44lowCD62LhiCD8+具有免疫記憶和干細胞的特性，在殺傷癌細胞方面具有更大的優勢［12，14］。這些結果為后續研究IL-21在腫瘤過繼免疫治療方面的作用奠定一些基礎，或許有助于在體外培養出足夠數量的CD44lowCD62LhiCD8+T細胞，再回輸患者體內，用于腫瘤治療。

［1］Yi JS，Cox MA，Zajac AJ.Interleukin-21:a multifunctional regulator of immunity to infections［J］.Microbes Infect，2010，12(14-15):1111-1119.

［2］Mehta DS，Wurster AL，Grusby MJ.Biology of IL-21 and the IL-21 receptor［J］.Immunol Rev，2004，202(1):84-95.

［3］Kasaian MT，Whitters MJ，Carter LL et al.IL-21 limits NK cell responses and promotes antigen-specific T cell activation:a mediator of the transition from innate to adaptive immunity［J］.Immunity，2002，16(4):559-569.

［4］Zeng R，Spolski R，Finkelstein SE et al.Synergy of IL-21 and IL-15 in regulating CD8+T cell expansion and function［J］.J Exp Med，2005，201(1):139-148.

［5］Wu Z，Kim H-P，Xue H-H et al.Interleukin-21 receptor gene induction in human T cells is mediated by T-cell receptor-induced Sp1 activity［J］.Mol Cell Biol，2005，25(22):9741-9752.

［6］Zeng R，Spolski R，Casas E，et al.The molecular basis of IL-21-mediated proliferation［J］.Blood，2007，109(10):4135-4142.

［7］Sondergaard H，Skak K.IL-21:roles in immunopathology and cancer therapy［J］.Tissue Antigens，2009，74(6):467-479.

［8］Davis ID，Brady B，Kefford RF，et al.Clinical and biological efficacy of recombinant human interleukin-21 in patients with stage IV malignant melanoma without prior treatment:a phase IIa trial［J］.Clin Cancer Res，2009，15(6):2123-2129.

［9］Petrella TM，Tozer R，Belanger K，et al.Interleukin-21 has activity in patients with metastatic melanoma:a phase II study［J］.J Clin Oncol，2012，30(27):3396-3401.

［10］Rosenberg SA，Spiess P，Lafreniere R.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes［J］.Science，1986，233(4770):1318-1321.

［11］Perret R，Ronchese F.Memory T cells in cancer immunotherapy:which CD8+T-cell population provides the best protection against tumours?［J］.Tissue Antigens，2008，72(3):187-194.

［12］Hinrichs CS，Spolski R，Paulos CM，et al.IL-2 and IL-21 confer opposing differentiation programs to CD8+T cells for adoptive immunotherapy［J］.Blood，2008，111(11):5326-5333.

［13］Cui W，Liu Y，Weinstein JS，et al.An interleukin-21-interleukin-10-STAT3 pathway is critical for functional maturation of memory CD8+T Cells［J］.Immunity，2011，35(5):792-805.

［14］Wherry EJ，Teichgraber V，Becker TC，et al.Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets［J］.Nat Immunol，2003，4(3):225-234.