不同類型音樂對老年大鼠腦組織海馬區神經細胞凋亡的影響①

何 穎 李淑梅 馬洪喜(長春大學音樂學院，長春 130022)

音樂可以鼓舞精神和激活大腦，引起強烈的快感和內在獎賞系統的假定刺激，這表明音樂的存在有利于精神和軀體的健康［1，2］。近年來越來越多的人開始關注音樂對健康的影響，發現彈奏、聆聽和創作音樂幾乎能夠影響每個認知功能，因此音樂提供了研究神經系統科學眾多方面的一個工具［3］。本實驗在聆聽音樂方面，通過音樂刺激老年大鼠，檢測血清、腦組織Caspase-3和Livin的水平，從神經細胞凋亡方面探討不同類型音樂對大鼠神經系統的作用機制為音樂治療的廣泛應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 健康老年雄性Wistar大鼠40只，20月齡，體重(360±20)g，由吉林大學白求恩醫學部動物實驗中心提供(動物許可證號:SCXK2007-吉大-0003);ELISA試劑盒購于南京建成生物有限公司;兔抗鼠Caspase-3和Livin一抗購于北京博奧森生物有限公司，SP和DAB試劑盒購于福州邁新生物有限公司;實時-PCR試劑購于塔克拉生物試劑有限公司。

1.2 實驗分組及實驗方法 健康老年雄性Wistar大鼠，隨機分為4組:空白對照組10只、莫扎特音樂組10只、梁祝音樂組10只和搖滾音樂組10只。每天上午水迷宮訓練同時音樂干預2 h，下午單純音樂干預2 h，音樂強度為65～85分貝連續7 d，第8天處死大鼠取血液及腦組織，待測試。

1.3 指標檢測

1.3.1 血清及腦組織海馬區中Caspase-3和Livin蛋白含量的檢測 采用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.2 腦組織海馬區中Caspase-3和Livin蛋白陽性表達的檢測 采用免疫組織化學法檢測，取腦組織固定于福爾馬林液中，包埋，切片4微米，60℃烤箱烘片4 h，然后脫蠟至梯度酒精至水洗，抗體稀釋液濃度均為1∶300，其余步驟嚴格按照說明書進行，DAB顯色后，用蘇木精復染，封片。采用Motic Image Advanced 3.2圖像分析儀，行半定量分析檢測灰度值，陽性表達越高灰度值越低，陽性表達越低灰度值越高。

1.3.3 腦組織海馬區中Caspase-3和Livin基因水平的檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測，Caspase-3上游引物:5'-TGGAACAAATGGACCTGTTG-3'，下游引物:5'-AGGACTCAAATTCTGTTGCC-3'，擴增產物256 bp;Livin上游引物:5'-TCCACAGTGTGCAGGAGACT-3'，下游引物:5'-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3'，擴增產物368 bp;β-actin上游引物:5'-CCTAAGGCCTAACCGTCGAA-3'，下游引物:5'-GGATGCCTAGGGCAGTAATC-3'，擴增產物 168 bp。

1.4 統計學分析 血清及腦組織中Caspase-3和Livin的蛋白含量、蛋白表達灰度值及基因變化水平，其實驗數據均表示，應用SPSS13.0統計軟件進行統計學處理，采用t檢驗分析。

2 結果

各組大鼠一般狀態均好，皮毛光滑、精神飽滿。

2.1 血清及腦組織海馬區中Caspase-3和Livin蛋白含量的比較 與對照組比較，莫扎特音樂組、梁祝音樂組大鼠血清及腦組織海馬區中Caspase-3蛋白含量降低、Livin蛋白含量升高均有統計學意義(P＜0.01)，莫扎特音樂組和梁祝音樂組之間比較無顯著差異(P＞0.05);而搖滾音樂組大鼠血清及腦組織海馬區中Caspase-3和Livin蛋白含量均無明顯改變(P ＞0.05)，見表1。

2.2 腦組織海馬區中Caspase-3和Livin蛋白陽性強度的比較 與對照組比較，莫扎特音樂組、梁祝音樂組大鼠腦組織海馬區中Caspase-3蛋白陽性表達強度降低、Livin蛋白陽性表達強度升高均有統計學意義(P＜0.01)，莫扎特音樂組和梁祝音樂組之間比較無顯著差異(P＞0.05);而搖滾音樂組大鼠腦組織海馬區中Caspase-3和Livin蛋白陽性表達強度均無明顯改變(P ＞0.05)，見表2，圖1、2。

2.3 腦組織海馬區中Caspase-3和Livin基因水平的比較 與對照組比較，莫扎特音樂組、梁祝音樂組大鼠腦組織海馬區中Caspase-3基因水平降低、Livin蛋白基因水平升高均有統計學意義(P＜0.01)，莫扎特音樂組和梁祝音樂組之間無顯著差異(P＞0.05);而搖滾音樂組大鼠腦組織海馬區中Caspase-3和Livin基因水平均無明顯改變(P＞0.05)，見表2。

表1 各組大鼠血清、腦組織海馬區中Caspase-3和Livin蛋白含量的比較(n=10，)Tab.1 Comparision of Caspase-3 and Livin protein contents in serum and hippocampus of brain tissue(n=10，)

表1 各組大鼠血清、腦組織海馬區中Caspase-3和Livin蛋白含量的比較(n=10，)Tab.1 Comparision of Caspase-3 and Livin protein contents in serum and hippocampus of brain tissue(n=10，)

Note:Compared with control group，1)P ＜0.01.

Groups Serum(ng/ml)Brain tissue(ng/ml)Caspase-3 Livin 5±0.93 1.03 Mozart music 2.31±0.651)9.51±0.841)3.48±0.751)10.78±0.971)Liangzhu music 2.42±0.491)9.39±0.721)3.53±0.691)10.63±1.121)Rock music 3.09±0.84 8.24±0.68 4.22±0.57 9.4 Caspase-3 Livin Control 3.16±0.52 8.11±0.63 4.33±0.78 9.34±

表2 各組大鼠腦組織海馬區中Caspase－3和Livin蛋白陽性強度(灰度值)及基因水平的比較(n=10，)Tab.2 Comparision of Caspase-3，Livin protein levels(grey value)and real-time PCR in hippocampus of brain tissue(n=10，)

表2 各組大鼠腦組織海馬區中Caspase－3和Livin蛋白陽性強度(灰度值)及基因水平的比較(n=10，)Tab.2 Comparision of Caspase-3，Livin protein levels(grey value)and real-time PCR in hippocampus of brain tissue(n=10，)

Note:Compared with control group，1)P ＜0.01.

Groups Protein levels(grey value)mRNA Caspase-3 Livin Control 113.24±4.18 110.56±5.24 5.21±0.76 1 Caspase-3 Livin 2 10.22±1.01 0.13±0.98 Mozart music 140.45±5.021)90.15±3.911)4.43±0.611)11.37±1.061)Liangzhu music 136.28±4.671)90.59±4.661)4.55±0.591)11.14±0.881)Rock music 116.53±4.16 116.41±4.72 5.14±0.8

圖1 腦組織海馬區中Caspase-3的表達(免疫組織化學染色，×400)Fig.1 Caspase-3 expression in hippocampus of brain tissue(Immunohistochemical staining，×400)

圖2 腦組織海馬區中Livin的表達(免疫組織化學染色，×400)Fig.2 Livin expression in hippocampus of brain tissue(Immunohistochemical staining，×400)

3 討論

音樂訓練可減少因老齡化而造成的記憶力下降，青少年時期學過音樂的人，老了后在記憶和認知能力方面的測試要推遲十年老化［4］。老年人進行持續的音樂活動可提高思維能力，消除因年齡甚至因缺乏教育而帶來的負面影響，在這項研究中70名59～80歲的音樂家和非音樂家進行了神經心理測驗和調查，在心理測試、視覺空間的判斷、言語記憶、回憶和機動靈活性方面，音樂家得分更高［5］。感知和處理音樂并不是后來才加到我們的認識上的，而是已經在我們周圍很久，從我們神經系統發展的最初階段就存在的了［6］。音樂有一個生物學基礎，而且大腦對音樂有一個功能組織，許多大腦區域參與了音樂處理過程的特殊方面，無論是對基本的感知還是喚起的情感反應，音樂家似乎具有額外的專門化作用，尤其是對一些大腦結構的超發展，這些效應表明了，音樂學習調節了大腦，增加了個體細胞的應答和細胞的數目［7］。國內外的研究表明特定的音樂對放松身心、振作精神、誘發睡眠等有實效，能提高機體學習記憶能力，能夠提高機體抗疲勞、抗衰老及調節機體的免疫機能，隨著對音樂和大腦研究的繼續，本實驗參照國內外大鼠相關研究，采用音樂強度65～85分貝干預，研究音樂干預在神經系統方面的調節機制［8-10］。

Caspase-3與Livin是神經系統中重要的損傷與抗損傷因子。Caspase-3能促進細胞凋亡，使細胞正常死亡;而Livin的表達能夠抗細胞凋亡。Caspase家族是直接導致凋亡細胞解體的蛋白酶系統，在細胞凋亡的分子機制網絡中居中心地位。可作用于一些其他的Caspase家族成員，并降解凋亡細胞中的某些成分，導致蛋白酶級聯反應放大，最終使細胞凋亡［11］。因此Caspase-3被稱為死亡蛋白酶，是哺乳動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶。大量實驗證明，如果在Caspase-3激活之前進行干預，可以有效抑制凋亡的發生［12］。近年用形態學或生化的方法均證實，衰老的腦組織神經元細胞具有典型的凋亡特征;其凋亡與Caspase-3的激活有關，Caspase-3的表達水平可作為衡量神經元損傷的客觀指標，其中海馬組織較皮層組織可能更為敏感。Livin是一類分子水平的抗細胞凋亡調節因子，它能夠鈍化宿主對感染的自殺反應，有學者證明，Livin能夠直接抑制Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9 酶水解作用，可能阻止Caspases蛋白在細胞凋亡時執行蛋白切除功能;Livin可引起Caspases蛋白的降解，還能通過抑制Caspases的活性途徑抗凋亡作用［13，14］。本實驗結果顯示，莫扎特音樂組、梁祝音樂組大鼠血清及腦組織中Caspase-3蛋白含量、蛋白表達和基因水平均較對照組降低有統計學意義(P＜0.01)，Livin蛋白含量、蛋白表達和基因水平均升高有統計學意義(P＜0.01)，莫扎特音樂組略好于梁祝音樂組差異無統計學意義(P＞0.05);而搖滾音樂組大鼠血清及腦組織中Caspase-3和Livin蛋白含量、蛋白表達和基因水平均較對照組無差異無統計學意義(P＞0.05);提示:音樂干預可通過下調Caspase-3、上調Livin水平，抑制神經細胞凋亡，對神經系統具有保護作用，這一結果也為音樂治療選擇背景音樂方面提供了理論依據。

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