MicroRNA-150通過降低CD122的表達調控NK及NKT細胞的分化①

張愛紅 鄭全輝 鄭建興 李 娟 侯志宏 劉亞楠 張慶波

(唐山市工人醫院，唐山 063000)

MicroRNAs(miRNAs)屬于短鏈非編碼RNAs，長度為20～23 nt，通過與靶mRNA 3'端非翻譯區結合，導致靶mRNA的降解或抑制其翻譯，負向調節靶基因的表達［1］。近來研究表明，眾多miRNAs在免疫系統中呈細胞類型和發育階段的特異性表達，并在調控多種適應性和固有免疫細胞的發育和功能中發揮作用［2，3］。miRNA合成關鍵酶Dicer敲除導致胸腺傳統T細胞、調節性T細胞(Treg)、NK、自然殺傷性T細胞(NKT)發育受阻，數量減少［4-7］。

但特異miRNAs在以上細胞中的作用并不十分清楚。有意思的是，盡管Dicer缺失對于B細胞、DC和巨噬細胞的發育和成熟影響不大，某些特異miRNAs的缺失或表達異常卻顯著影響以上細胞的發育和功能發揮［7-10］。因此，特異miRNA在某些免疫細胞的發育、成熟和功能的調控中可能扮演重要角色。

MicroRNA-150(miR-150)廣泛表達于機體多種免疫細胞，Zhou等［8］發現miR-150缺失致B細胞異常擴增，體液免疫應答顯著增強。我們近期研究結果表明，miR-150缺失不影響傳統αβT細胞的產生和發育，但導致NKT細胞發育阻止在終末成熟階段［11］。在此研究中，我們進一步探討了miR-150缺失對調節性T細胞(Treg)、γδT、NK及NKT細胞產生和自穩的影響，發現miR-150缺失對Treg和γδT細胞的產生不發揮明顯作用，但導致NK和胸腺NKT細胞的數量顯著降低，miR-150缺失導致小鼠NK及NKT細胞中CD122的表達顯著降低，細胞發育受阻，凋亡增加，同時NK細胞的增殖能力顯著降低。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠 C57BL/6背景的miR-150基因敲除小鼠(miR-150KO)和野生型對照 C57BL/6小鼠(WT)由Qing-Sheng Mi博士(美國密歇根州亨利福特醫院)惠贈，并在河北聯合大學SPF級小鼠房繁殖、飼養。實驗選取4～6周齡、性別匹配小鼠進行研究。小鼠實驗操作按河北聯合大學實驗動物管理委員會規定進行。miR-150敲除小鼠基因型鑒定采用下列引物:上游:5-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3;下游5-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3，miR-150KO小鼠產生262 bp片段，WT小鼠產生866 bp片段。

1.1.2 試劑 miRVana miRNA提取試劑盒和Taq-Man MicroRNA檢測試劑盒購自美國Ambion公司，熒光素標記的α-Galcer/CD1d四聚體購自日本麒麟公司。熒光素標記的抗小鼠 TCR-β(H57-597)、抗CD4(RM4-5)，抗 CD25(PC61)，抗 γδTCR(11F2)，抗NK1.1(PK136)，抗 CD122(5H4)，抗 Brdu 抗體，抗Foxp3(FJK-16s)抗體及胞內染色試劑盒，以及Annexin V染色試劑盒購自BD或eBioscience公司，Brdu購自Sigma公司。大鼠抗小鼠FcR單克隆抗體(2.4G2)取自2.4G2雜交瘤細胞培養上清，引物由上海生物工程服務公司合成。

1.2 方法

1.2.1 實時定量RT-PCR 提取細胞總RNA，采用TaqMan MicroRNA檢測試劑盒進行反轉錄和PCR擴增，以snoRNU202作為內參照。PCR擴增產物檢測采用ABI 7900 Real-Time PCR system進行，結果分析采用Log2值，并計算相對表達。

1.2.2 流式細胞儀分析 分離小鼠胸腺和脾臟并制成單細胞懸液，用含2%小牛血清的PBS染色緩沖液洗滌兩次，加入2.4G2封閉，4℃ 30 min，然后直接加入適當濃度熒光素標記的單克隆抗體，4℃ 30 min。染色緩沖液洗滌兩次，采用BD-LSRⅡ流式細胞儀收集標本，CellQuest Pro(BD Biosciences)軟件進行數據分析。細胞凋亡分析采用Annexin V染色試劑盒，按說明書操作，數據分析同上。

1.2.3 細胞內染色 胸腺及脾臟淋巴細胞首先進行如上細胞表面染色，4℃ 30 min，染色緩沖液洗滌兩次，加入1∶3混合的Fixation/Permeabilization緩沖液。4℃固定、打孔60 min，采用透膜緩沖液洗滌兩次，加入抗Foxp3抗體，4℃ 30 min，染色緩沖液洗滌兩次后上機檢測。

1.2.4 Brdu摻入法檢測細胞增殖 小鼠每24 h腹腔注射Brdu 1 mg/小鼠，連續注射3 d。小鼠處死后收集胸腺和脾臟細胞，首先進行細胞表面染色，4℃30 min。細胞經固定、透膜后加入DNase I(100 μg/ml)，37℃，1 h，加入熒光素標記抗Brdu單克隆抗體染色，流式細胞儀分析同上。

1.3 統計學分析 采用GraphPad Prism v5.0軟件，進行數據處理和統計分析，結果采用雙尾Student's t檢驗，P＜0.05為組間有統計學差異。

2 結果

2.1 miR-150敲除不影響調節性T細胞(Treg)和γδT細胞的產生 采用loxP-Cre酶系統制備miR-150基因敲除小鼠。基因鑒定miR-150敲除小鼠產生262 bp的DNA擴增片段，而野生型小鼠產生866 bp的DNA擴增片段(圖1A)。Real-time PCR結果顯示，與正常對照組小鼠(WT)相比，miR-150基因敲除小鼠(150KO)中miR-150的表達顯著降低(圖1B)。分離WT正常對照和miR-150基因敲除小鼠胸腺和脾臟細胞，采用抗小鼠 CD4、CD25和抗Foxp3抗體染色，觀察miR-150敲除對小鼠CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞(Treg)產生的影響，發現miR-150缺失不影響胸腺和外周Treg細胞的產生(圖1C、D)。同時，抗小鼠γδTCR抗體染色結果顯示，miR-150缺失也不影響胸腺和外周γδT細胞的產生(圖1E、F)。

2.2 miR-150敲除致NK和胸腺NKT細胞數量減少 NK和NKT細胞是兩類重要的固有免疫細胞，二者在表型和功能上均存在諸多相似之處［12］。采用抗TCRβ和NK1.1抗體染色檢測胸腺和脾臟NK細胞，以及聯合 α-GalCer/CD1d四聚體染色檢測NKT細胞的產生。發現與WT小鼠相比，miR-150敲除小鼠胸腺和脾臟NK細胞的比例和數量均顯著降低(圖2A～C)。NKT細胞的數量在miR-150敲除小鼠胸腺中也顯著降低。而與WT小鼠相比，NKT細胞在miR-150敲除小鼠脾臟中沒有顯著變化(圖2D～F)。

2.3 miR-150敲除致MK和胸腺NKT細胞CD122表達降低 NK1.1和CD122在小鼠NK和NKT細胞發育、成熟過程中表達增加，是NK及NKT細胞發育過程中的特異性標志分子［13］。檢測miR-150敲除小鼠NK及NKT細胞中NK1.1和CD122的表達變化。發現與WT對照組小鼠相比，miR-150敲除小鼠NK細胞中NK1.1和CD122的表達陽性率顯著降低(圖2A，圖3B);同時，miR-150敲除小鼠胸腺NKT細胞中NK1.1和CD122的表達陽性率也顯著降低(圖3C、D);但 miR-150敲除小鼠脾臟NKT細胞中NK1.1和CD122的表達與對照小鼠相比，沒有顯著變化(圖3E、F)。通過比較miR-150敲除與WT對照小鼠脾臟NK及胸腺NKT細胞NK1.1和CD122的平均熒光強度(MFI)，發現與WT小鼠相比，miR-150敲除小鼠 NK及胸腺NKT細胞中NK1.1的表達沒有顯著變化，而CD122的表達顯著降低(圖3G、H)。

2.4 miR-150敲除促進NK和NKT細胞凋亡miR-150缺失引起的NK和NKT細胞減少除與其發育有關外，還可能與細胞凋亡或增殖異常有關。采用熒光標記的磷脂結合蛋白Annexin V染色檢測細胞凋亡，發現與WT對照小鼠相比，miR-150基因敲除小鼠NK和胸腺NKT細胞凋亡顯著增加(圖4A～D)。

2.5 miR-150敲除抑制NK細胞增殖 采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)體內摻入法檢測miR-150缺失對NK和NKT細胞增殖的影響，發現與WT對照小鼠細胞相比，miR-150基因敲除小鼠脾臟NK細胞的增殖能力顯著降低，而miR-150缺失對小鼠NKT細胞的增殖能力沒有顯著影響(圖5A～D)。

圖1 miR-150敲除不影響調節性T細胞(Treg)和γδT細胞的產生Fig.1 Production of Treg and γδT cells in miR-150KO mice

圖2 miR-150敲除小鼠NK細胞和胸腺NKT細胞數量顯著降低Fig.2 Decreased NK and thymus NKT cells in miR-150KO mice

圖3 miR-150敲除致小鼠NK和胸腺NKT細胞CD122表達降低Fig.3 Decreased CD122 expression in NK and thymus NKT cells of miR-150KO mice

圖4 miR-150敲除促進小鼠NK和NKT細胞凋亡Fig.4 Increased apoptosis of NK and thymus NKT cells in miR-150KO mice

圖5 miR-150敲除抑制小鼠NK細胞增殖Fig.5 Decreased proliferation of NK cells in miR-150KO mice

3 討論

miR-150是在免疫細胞中普遍表達的一種microRNA，已有研究表明，miR-150在B細胞的發育、分化中發揮作用，但不影響胸腺傳統T細胞的發育和成熟。在此研究中，我們發現miR-150的缺失對另外兩類重要的T細胞亞群-Treg和γδT細胞的產出也不發揮主要作用。有意思的是，在具有相似表型和功能的兩類參與固有免疫應答的細胞NK和NKT細胞中，miR-150的存在直接影響二者的發育和自穩，miR-150敲除NK和胸腺NKT細胞NK1.1和CD122陽性細胞比例和CD122的表達顯著降低，NK細胞的凋亡增加，增殖降低。同時，miR-150的缺失也導致胸腺NKT細胞的凋亡增加，但對其增殖影響不顯著。

NK細胞來源于骨髓淋巴樣干細胞，NK前體細胞能夠遷移至胸腺、脾臟、肝臟、淋巴結等部位，進一步發育分化為成熟NK細胞并主要分布于外周血和脾臟。NK細胞的發育和成熟受一系列細胞因子的調控，其中，IL-2和IL-15是最重要的兩個細胞因子，二者共用IL-2受體βγ亞單位，激活相同的信號通路。NK細胞在IL-2的作用下表現為較強的活化、增殖作用，而IL-15可以維持 NK 的生存，抑制其凋亡［14，15］。NK1.1和CD122是小鼠NK細胞相對特異性標記分子，在成熟NK細胞中表達顯著增加。更為重要的是，CD122為IL-2受體β鏈，為IL-2和IL-15的共用受體，CD122表達降低致NK細胞發育和成熟障礙［16，17］。

NKT細胞因其細胞表面既表達TCRα鏈(小鼠:Vα14-Jα18，人:Vα24-Jα18)和 Vβ 鏈(小鼠:Vβ8.2、Vβ7、Vβ2，人:Vβ11)，同時又表達 NK 細胞受體如NK1.1、IL-2/15 受體 β(CD122)等而命名［18］。NKT前體細胞產生于胸腺，但其最后階段的發育、成熟過程既可在胸腺直接完成，也可離開胸腺進入肝臟、脾臟、骨髓和淋巴結等外周免疫器官完成。因此，NKT細胞的發育、成熟既發生在胸腺，也發生在外周免疫器官。同時。NKT細胞的發育、成熟也伴隨著多種細胞表面分子的表達變化，如CD44、NK1.1、CD122等的表達增加［19］。與NK細胞一樣，IL-15也是調控NKT細胞發育、成熟及自穩的關鍵細胞因子［20，21］。

在此研究中，我們發現與正常對照小鼠相比，miR-150敲除小鼠NK及胸腺NKT細胞數量顯著減少。由于NK細胞占胸腺細胞比例很低(0.02%，圖2A)，所以我們主要選取脾臟NK細胞進行后續實驗的研究。進一步研究發現，miR-150敲除主要導致具有NK1.1+CD122+成熟表型的NK和NKT細胞比例的降低，表明miR-150促進NK和NKT細胞的發育、成熟。與正常對照小鼠相比，miR-150敲除小鼠脾臟NKT細胞數量正常圖2 d，提示在終末成熟階段，NKT細胞在胸腺和外周可能存在不同的調控機制，而miR-150對于外周NKT細胞的發育、成熟不發揮主要作用。鑒于CD122在miR-150敲除小鼠NK和NKT細胞中的表達降低以及IL-15在二者發育、成熟和自穩中的重要作用。我們進一步研究了miR-150敲除對于NK和NKT細胞凋亡和增殖的影響，結果證實，miR-150敲除所致NK和NKT細胞的減少與其凋亡增加有關。同時，miR-150缺失也導致NK細胞的增殖降低，但對NKT細胞的增殖沒有顯著影響，表明NKT細胞CD122的表達主要在于維持其自穩功能，而NKT的增殖可能主要與其TCR活化信號有關［22，23］。

總之，本研究發現miR-150在調控NK和NKT細胞發育和自穩過程中發揮作用，miR-150缺失所致NK和NKT細胞的數量減少與其增殖降低和/或凋亡增加有關，CD122可能在以上過程中發揮重要作用。由于特異microRNA的缺失通常引起其靶基因的表達增加，由此推測，miR-150敲除小鼠NK和NKT細胞中CD122的表達變化可能不是miR-150直接作用的結果。我們以前實驗結果也表明，miR-150在NKT細胞中可能主要通過c-myb調控NKT細胞的發育［24］。因此，c-myb是否影響CD122的表達以及c-myb在NK細胞發育的作用尚需在以后實驗中深入探討。

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