PIMT對類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡的影響①

張 慧 宗 明 李 牛 虞珊珊 孫立山 范列英

(上海市東方醫院同濟大學附屬東方醫院，上海 200120)

前期研究發現蛋白異天冬氨酰甲基轉移酶(Protein isoaspartyl-methyltransferase，PIMT)在類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)滑膜成纖維樣細胞(Fibroblast-like synoviocytes，FLS)中表達下降［1］，而PIMT是與細胞增殖、凋亡相關的甲基轉移酶［2，3］。本研究通過將 PIMT 表達載體轉染 RAFLS，在RA-FLS細胞中的過表達PIMT，探討PIMT對于RA-FLS細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 原代RA-FLS(本室保存)

1.1.2 載體 pcDNA3.1(－)B-flag(本室保存)。

1.1.3 引物設計與合成

1.1.3.1 PIMT表達質粒引物的設計與合成 根據NCBI數據庫中PIMT基因mRNA序列設計擴增引物，primer1:5'-TAACTCGAGACCATGCCGGGAGCGCGCAGT-3'，primer2:5'-TAAGGATCCCTTCAACCTGGACCACTGCTTTTCTTTATCTG-3'，于引物的 5'端加上BamHⅠ和XholⅠ限制性內切酶位點和保護堿基，擴增片段長度855 bp，引物由上海Invitrogen公司合成。

1.1.3.2 PIMT半定量熒光PCR引物設計與合成

根據NCBI數據庫中PIMT基因mRNA序列設計擴增引物，primer1:5'-TGGGAAAACTGCTGGGCACCG-3'，primer2:5'-GGTTTCCGCCTGCAGGACCAA-3'。管家基因 GAPD H引物為primer1:5'-TGACTTCAACAGCGA-3'，primer2:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3';引物由上海Invitrogen公司合成。

1.1.4 主要試劑 RPMI1640培養液、胎牛血清、胰酶(美國 Gibco公司)，25 cm2培養瓶，6孔板，10 cm2培養皿(美國Corning公司)，總RNA抽提試劑Trizol(美國Invitrogen公司)，RNA逆轉錄試劑盒(美國 Invitrogen公司)，SYBR Green PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)，LipofectamineTM轉染試劑(美國Invitrogen公司)，抗flag單克隆抗體(美國Sigma公司)，羊抗鼠HRP抗體(Abcam公司)，Annexin VFITC流式檢測凋亡試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.1.5 主要實驗儀器 水平電泳儀(美國Bio-Rad公司)，ABI 7300熒光定量 PCR儀(美國 ABI公司)，Kubota 3500臺式高速低溫離心機(日本Kubota公司)，天能(Tanon)凝膠成像系統(江蘇海門市麒麟醫用儀器廠)，流式分析儀(BD)，CO2培養箱(FORMA)，倒置式系統顯微鏡(OLYMPUS)，超凈臺(BAKER)，電熱恒溫水浴箱。

1.2 方法

1.2.1 RA-FLS細胞的原代培養 關節鏡手術中取出的滑膜組織用無菌手術剪剪成1 mm3大小，以5 mm的間距均勻排列于25 cm2培養瓶的培養面上，加入含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液，以濕潤組織為宜，將培養瓶的培養面向上置于37℃，5%CO2培養箱中培養。4～5 h后將培養瓶緩慢翻轉平放，靜置培養。24 h后更換培養液，以后每2～3 d更換培養液一次，待FLS成片生長時，去除組織塊繼續培養。待RA-FLS長至70%～80%時進行細胞傳代。本研究中所用RA-FLS為3～5代細胞。

1.2.2 PIMT表達質粒的構建

1.2.2.1 外周血單個核細胞(PBMC)分離 抽取健康體檢者靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝，用淋巴細胞分離液分離PBMC，加Trizol 1 ml，－20℃保存，用于RNA制備。

1.2.2.2 抽提總RNA 將上述標本按Trizol操作說明書提取總RNA，終體積30 μl。0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量有無降解。紫外分光光度儀測定260/280 nm吸光值(OD)，確定RNA的含量和純度。

1.2.2.3 RNA逆轉錄成cDNA 在薄壁管中配制反應溶液: 總 RNA 2 μg，oligo primer(50 μmol/L)1 μl，dNTP mix(10 μmol/L)1μl，加入經 DEPC 處理的ddH2O 至總體積 10 μl，65℃ 預變性 5 min。繼續配制cDNA第一鏈合成反應體系:10×RT buffer 2 μl，MgCl2(25 μmol/L)4 μl，DTT(0.1 mol/L)2 μl ，RNAase OUT(40 U/μl)1 μl，SuperScrip Ⅲ RT(200 U/μl)1 μl，至總體積 20 μl。50℃保溫 50 min 后，85℃變性5 min終止反應，4℃保存備用。

1.2.2.4 PCR擴增目的片段 反應體系共50 μl，5 × PS buffer 10μl，dNTP Mix 4 μl，Primer Mix(20 μmol/L)1 μl，cDNA 4 μl，Primer Star 0.5 μl，加ddH2O 至50 μl體積。擴增條件:98℃ 10 s，68℃ 1 min，共42個循環。

1.2.2.5 PIMT陽性克隆的制備 PCR產物的純化按說明書操作;純化產物與pcDNA3.1(-)B-flaghrGFP載體進行連接，操作按說明書。常規制備感受態大腸桿菌Top10;連接產物全量(10 μl)轉化感受態大腸桿菌Top10;PCR篩選鑒定陽性克隆，得到PIMT片段的克隆質粒 pcDNA3.1(－)B-flag-PIMT。質粒送上海邁普生物公司測序，最終證實PIMT的cDNA片段序列的正確性。抽提、純化重組質粒 pcDNA3.1(－)B-flag-hrGFP-PIMT，PCR 擴增檢測質粒。

1.2.3 PIMT表達質粒轉染RA-FLS 轉染前一天種2×106個細胞于6孔板中，置于37℃，5%CO2培養箱中培養過夜。將2 μg質粒 DNA溶于500 μl Opti-Mem無血清培養基中;將5 μl lipo2000溶于500 μl Opti-MEM無血清培養基中，混勻室溫放置5 min。將上述兩管溶液混合，放置30 min后加入6孔板對應孔中，4～6 h時換成含有血清的1640培養基。

1.2.4 PIMT mRNA在RA-FLS細胞中的表達 轉染48 h后，收集細胞，抽提細胞 mRNA，逆轉錄成cDNA，實時熒光定量PCR檢測PIMT mRNA表達水平。定量PCR反應體系如下:2 μl cDNA，引物1和引物 2 各 0.5 μl(20 μmol/L)，ddH2O 9 μl，0.5 μl ROX，2 ×SYBR Premix EX Taq 12.5 μl，混勻后置熒光定量PCR儀進行反應。反應條件為:95℃預變性30 s，再進行40個循環:95℃ 5 s，60℃ 31 s，最后延伸1個循環:60℃ 1 min，95℃ 15 s。循環結束后進行熔解曲線測定。基因表達相對水平計算:PIMT基因相對于管家基因GAPDH的表達水平根據 2－ΔCt計算，ΔCt=Ct(待測基因)－Ct(GAPDH)，各樣品間的模板量平衡采用與上述標準參考樣品間ΔCt值進行校正，RA-FLS細胞中PIMT基因相對于管家基因GAPDH的表達水平最終用2－ΔCt計算公式進行轉換，重復該實驗三次。

1.2.5 PIMT蛋白在RA-FLS細胞中的表達 轉染48 h后，收集細胞，提取細胞總蛋白并定量，Western blot檢測PIMT蛋白表達水平:SDS-PAGE蛋白電泳分離樣品，轉膜50 min，室溫封閉2 h，加一抗antiflag(1∶10 000)4℃過夜，用PBST洗滌三次后加二抗(1∶5 000)室溫反應30 min，PBST洗滌三次后掃描。

1.2.6 PIMT對RA-FLS細胞凋亡的影響 用4℃預冷的PBS洗細胞兩次，用250 μl結合緩沖液重懸浮細胞，調節其濃度為1×105ml－1。取100 μl的細胞懸液于 5 ml流式管中，加入 5 μl的 Annexin V/FITC 和 10 μl 20 μg/ml的碘化丙錠溶液。混勻后于室溫避光孵育15 min。在反應管中加入400 μl的PBS，流式細胞儀(FITC)分析。

1.3 統計學分析 所有數據采用SPSS16.0軟件進行統計學分析;配對數據采用t檢驗，P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 PIMT表達質粒的構建 將PCR產物連接至pcDNA3.1(－)B-flag-hrGFP載體上后，轉化大腸肝菌Top10得到重組質粒，PCR法和雙酶切鑒定陽性克隆，同時該陽性克隆質粒經邁普公司測序鑒定，證明序列與Genebank的序列基本一致，但在565 bp處 C→T，經 BLAST比對，此處為 SNP位點(rs17355457)，見圖1。

2.2 PIMT表達質粒的轉染 于轉染48 h后收集細胞，半定量熒光PCR檢測RA-FLS細胞mRNA變化情況。正常對照中PIMT mRNA相對于GAPDH的表達水平是0.202拷貝/ml，轉染空載體的陰性對照是0.273拷貝/ml，而轉染了 pcDNA3.1-PIMT載體的RA-FLS細胞中PIMT mRNA相對于GAPDH的表達水平則是2.657拷貝/ml，與正常對照和陰性對照相比，有約13倍的升高，結果有統計學意義(t=19.287，P ＜0.01，圖2)。Western blot檢測 PIMT 蛋白變化水平，用抗flag抗體檢測PIMT在RA-FLS中的表達，結果顯示，轉染了pcDNA3.1-PIMT載體的RA-FLS細胞能檢測到抗flag抗體的表達，而空白對照和陰性對照中不能檢測到抗flag抗體的表達(圖3)。

2.3 PIMT對RA-FLS細胞凋亡的影響 于轉染48 h后收集細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡變化情況，與正常對照相比較，轉染了PIMT表達載體的細胞凋亡水平升高由5.11%上升至12.74%;與轉染空載體的陰性對照相比較，轉染表達載體的RA-FLS細胞凋亡水平由12.74%上升至22.59%(圖4)，結果有統計學意義(t=4.448，P＜0.01)。

圖1 PIMT表達質粒測序結果(正向，反向)Fig.1 PIMT expression plasmid sequencing results(Forward，Reverse)

圖2 轉染PIMT表達載體后，RA-FLS細胞PIMT mRNA變化(P＜0.01)Fig.2 Expression level of mRNA of PIMT changed(P ＜0.01)

圖3 轉染PIMT表達載體后，Western blot檢測抗flag抗體Fig.3 Western blot analysis for anti-flag after transfected vector of PIMT into RA-FLS

圖4 轉染PIMT表達載體后，RA-FLS細胞凋亡的變化(P＜0.01)Fig.4 Apoptosis level of RA-FLS changed after 48 h transfected with expressed plasmid(P＜0.01)

3 討論

類風濕關節炎是一種常見的自身免疫病，我國發病率約為0.3%～0.5%，是造成人群勞動力喪失和致殘的主要疾病之一。RA的基本病理改變是持久反復發作的關節滑膜慢性增生性非化膿性炎癥，侵入滑膜下軟骨和骨質，最終導致關節畸形和功能喪失［4］。近年來的研究證明RA-FLS的增殖與凋亡失調是關節滑膜炎性增生，關節破化的主要原因之一［5，6］。因此，尋找與 FLS 增殖/凋亡失調相關的蛋白質，并闡明該蛋白質在FLS增殖與凋亡失調中的具體調節機制，對研究RA發病機制和尋找治療靶點具有重要意義。我們前期研究發現，PIMT在類風濕關節炎滑膜成纖維樣細胞中(RA-FLS)中表達下降，而PIMT是一個與細胞增殖、凋亡相關的甲基轉移酶，因此，本研究通過在RA-FLS細胞中過表達PIMT，探討PIMT對RA-FLS細胞凋亡的影響。

生理條件下，蛋白質中的L-天冬酰胺酰殘基(L-asparaginyl residues)和L-天冬氨酰殘基(L-aspartyl residues)會自發的脫氨酰或異構化形成異常的L-天 冬 氨 酰(abnormall-isoaspartylresidues，L-isoAsp)，這種異常的L-isoAsp在蛋白內集聚能改變蛋白質的結構并影響蛋白質功能［7，8］。PIMT是普遍存在于原核細胞與真核細胞中的修復酶，在生理條件下能識別并轉移S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，AdoMet)中甲基基團至異常的L-天冬氨酰(L-isoaspartyl)殘基中的游離羧基上，修復異常的L-天冬氨酰殘基轉變成正常的L-天冬氨酰，并恢復蛋白質的結構和功能。研究顯示，與正常的小鼠相比較，敲除PIMT基因的小鼠其CD4+T淋巴細胞和脾細胞過度增殖，而將這種小鼠的骨髓移植給正常小鼠，會產生抗DNA抗體和表現典型紅斑狼瘡腎炎的病理變化［9］。而在腫瘤細胞中PIMT基因的缺失也能引起細胞增殖。在小鼠皮質神經元細胞和COS-1細胞系中，PIMT基因缺失會導致細胞抵御Bax誘導的凋亡［10］。

本研究通過構建PIMT表達質粒并轉染RAFLS細胞，發現PIMT表達質粒轉染至RA-FLS細胞后，PIMT在mRNA水平和蛋白水平均明顯升高，表明PIMT表達載體轉染 RA-FLS細胞成功;轉染PIMT表達載體的RA-FLS細胞的凋亡水平明顯高于陰性對照RA-FLS細胞，表明PIMT升高會引起RA-FLS細胞凋亡上升，因此PIMT在RA-FLS細胞中表達下降是RA-FLS細胞凋亡減少的重要原因之一，PIMT對RA-FLS細胞增殖/凋亡失調中有一定的調節作用。

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