靶向livin的siRNA對鼻咽癌細胞增殖和凋亡的影響①

何躍平 羅晶晶 劉 釗 安 立 李祥東 張 艷

(遵義醫學院第五附屬珠海醫院耳鼻喉科，珠海 519100)

livin是近年來發現的人類凋亡抑制蛋白家族(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)新成員，在大多數正常成人組織不表達，而在多種腫瘤細胞中出現高表達［1，2］，與腫瘤抗凋亡效應明顯相關。livin 基因有livin-α和livin-β兩個異構體，分別編碼長度為298和280個氨基酸的蛋白質，它們的功能略有不同［3］。本實驗利用siRNA技術沉默livin基因的表達，觀察 livin表達下調對鼻咽細胞系 CNE-2Z caspase-3的活性、增殖和凋亡的影響，為鼻咽癌基因治療提供新的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 鼻咽癌細胞系CNE-2Z由本室保存;RT-PCR試劑盒購自北京博大泰克;質粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒購自Axygen公司;caspase-3活性檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所;鼠抗人livin單克隆抗體購自Abcam公司;LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司;小牛血清購自杭州四季青。

1.2 livin siRNA表達載體的構建 livin siRNA表達載體的構建見參考文獻［4］。基于livin-β僅比livin-α連續少54個堿基，即 livin-α包含了 livin-β的全部堿基序列，針對 livin-β(GenBank NM_022161)，即 livin-α 和 livin-β 的共有區設計靶向livin的siRNA序列。

1.3 CNE-2Z細胞培養和基因轉染 鼻咽癌細胞CNE-2Z用含10%小牛血清的RPMI1640培養于37℃、5%CO2孵箱中培養傳代，收集對數生長期細胞，以2.0×105ml－1接種于 24孔板，過夜培養，待細胞長至90%孔底面積時分別以實驗組重組質粒(pGPU6/GFP/Neo-livin)、陰性對照質粒(pGPU6/GFP/Neo-shNC，無關序列對照組)轉染 CNE-2Z細胞，具體操作按LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行，同時以未轉染質粒的CNE-2Z細胞為空白對照組。轉染后24 h于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效果，分別于轉染后0～72 h收集細胞檢測相關實驗指標。

1.4 RT-PCR檢測livin沉默后mRNA表達情況將各組細胞濃度調至6.0×105ml－1接種于6孔板，分別于轉染后24、48、72 h提取細胞總RNA。根據GeneBank提供的livin、β-actin mRNA序列設計引物(表1)。紫外分光光度計測定RNA濃度，保證反轉錄體系中每組所加RNA的量相同。以β-actin作為內參照檢測基因表達水平，RT-PCR產物以2.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察目的片段，利用AlphaImager 2200軟件進行灰度分析并計算livin mRNA表達抑制率。

1.5 Western blot檢測livin沉默后蛋白表達情況常規提取細胞總蛋白，取60 μg蛋白上樣到12%SDS-PAGE凝膠，電泳后轉移至PVDF膜，分別用抗livin抗體(1∶1 000)和抗 β-actin 抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，再與辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育1 h。TBST洗膜后在暗室X片曝光1 min左右，顯影、定影后成像拍照。

1.6 caspase-3活性檢測 將CNE-2Z細胞總濃度調整成1.0 ×105ml－1接種于24 孔板，每孔500 μl培養24 h后進行同步化處理，分別于轉染后0、12、24、48 h后收集細胞，依照caspase-3活性檢測試劑盒說明書提取蛋白，以酶標儀測定色敏底物DEVD-pNA被蛋白酶分解后的pNA在405 nm波長處的吸光度值。

表1 PCR引物序列及擴增產物長度Tab.1 Sequence of PCR primers and lengths of amplification products

1.7 MTT法檢測細胞增殖活性 將CNE-2Z細胞濃度調整成1.0×104ml－1，接種于96孔培養板，每組設3個復孔，每孔加200 μl培養液培養24 h后進行同步化處理，分別于轉染后12、24、48、72 h每孔加入 5 mg/ml的 MTT(20 μl/孔)，37℃ 孵育 4 h 后棄上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩裂解10 min待藍色結晶溶解后，酶標儀測定570 nm波長處吸光度(A)值。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集轉染后48 h的各組CNE-2Z細胞，2 000 r/min離心5 min后棄上清，用4℃預冷的70%乙醇固定。4℃固定18 h后調整細胞濃度為1.0×106ml－1，取1 ml細胞懸液，PBS洗3次，細胞重懸于1 ml PI染液中，37℃孵育30 min進行流式分析。

1.9 統計學分析 數據分析用SPSS18.0軟件進行，各組間差異比較采用方差分析，組間百分率采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞轉染率的觀察 siRNA重組質粒轉染CNE-2Z細胞24 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞轉染率約為60%～70%(圖1)。

2.2 siRNA抑制CNE-2Z細胞中livin mRNA的表達 RT-PCR檢測結果顯示:實驗組pGPU6/GFP/Neo-livin重組質粒轉染細胞48 h后livin mRNA表達水平明顯受到抑制(圖2，泳道4)，與空白組相比抑制率達到64.38%，陰性對照組與空白組相比，livin mRNA表達無明顯變化(P＞0.05)。

圖1 基因轉染熒光顯微鏡照片圖(×100)Fig.1 Fluorescent microscope photograph of gene transfection(×100)

2.3 siRNA抑制CNE-2Z細胞livin蛋白的表達Western blot結果顯示:實驗組pGPU6/GFP/Neo-livin重組質粒轉染細胞48 h后livin蛋白表達水平明顯受到抑制(圖3)，與空白組相比抑制率達61.43%，而陰性對照組與空白對照組相比livin蛋白表達無明顯差異(P＞0.05)。

圖2 pGPU6/GFP/Neo-livin質粒對CNE-2Z細胞livin mRNA表達水平的影響Fig.2 Effect of pGPU6/GFP/Neo-livin plasmid on livin mRNA level in CNE-2Z cells

圖3 pGPU6/GFP/Neo-livin質粒對CNE-2Z細胞livin蛋白表達水平的影響Fig.3 Effect of pGPU6/GFP/Neo-livin plasmid on livin protein level in CNE-2Z cells

圖4 各組細胞caspase-3的活性檢測Fig.4 Detection of caspase-3 activity in different groups

2.4 caspase-3酶活性變化 檢測結果顯示:pGPU6/GFP/Neo-livin轉染 CNE-2Z細胞后，caspase-3酶活性隨轉染時間的延長逐漸增高，轉染后48 h達到最高(圖4)，pNA含量為6.68 nmol/L，而空白對照組和陰性對照組則不能有效地激活caspase-3的活性。

2.5 細胞增殖活性的變化MTT法檢測各組細胞轉染后0～72 h生長情況，結果顯示，與對照組相比，實驗組pGPU6/GFP/Neo-livin重組質粒轉染后能顯

圖5 pGPU6/GFP/Neo-livin質粒對CNE-2Z細胞增殖的影響Fig.5 Effect of pGPU6/GFP/Neo-livin plasmid on cell proliferation of CNE-2Z cells

表2 各組細胞凋亡率(%)Tab.2 Apoptosis rate of CNE-2Z cells in each group(%)

圖6 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡水平代表圖Fig.6 Representative diagrams of cell apoptosis detected by flow cytometry

著抑制CNE-2Z細胞的增殖，并呈時間依賴性，抑制率最高達38.7%(P＜0.01)，而空白組和陰性對照組細胞增殖活性未見改變(圖5)。

2.6 轉染后CNE-2Z細胞凋亡率的變化 轉染后48 h，livin特異性siRNA組細胞的凋亡率顯著增加，與空白組和陰性對照組比較差異有顯著性(P＜0.01)，說明沉默livin的表達可增加細胞的凋亡(表2、圖6)。

3 討論

惡性腫瘤細胞凋亡失衡與腫瘤發生、發展、復發和患者預后有著密切關系［5］。抑制IAPs家族成員蛋白表達，誘導腫瘤細胞發生凋亡，是目前腫瘤靶向治療的一個新的研究方向［6］。livin是近年發現的人類IAP家族的新成員，與腫瘤有較強的相關性，可在多種腫瘤細胞中高表達，而在正常分化成熟組織中基本不表達［7］。RNA干擾(RNAi)是近年發展起來的一種轉錄后水平的基因沉默技術，它是由生物體細胞內外源性或內源性的雙鏈RNA所引起的序列特異性基因沉默現象。與反義寡核苷酸技術、基因敲除技術及抗體介導的基因表達沉默技術相比，RNAi具有特異性強、抑制效率高等優點，已被廣泛應用于功能基因組學以及疾病的基因治療等方面［8］。本實驗利用RNAi技術成功地抑制了CNE-2Z細胞中livin mRNA和蛋白的表達，抑制率分別為64.38%、61.43%，說明所選擇的siRNA序列具有良好的干擾效率。

與其他IAP家族成員相似，livin包含1個串聯的含有半胱氨酸/組氨酸的桿狀病毒IAP重復區(Baculovirus IAP repeat，BIR)的結構，相鄰的羧基末端含有一個環指結構。livin的抗凋亡活性就主要依賴于其BIR的結構域。體外實驗證實livin和其下游的caspase-3、caspase-7的相互作用是也依賴于BIR結構域［3］。livin抑制細胞凋亡主要是通過直接抑制凋亡蛋白酶(caspases)而實現的，Vucic等［9］發現livin可與 caspase-3、caspase-9及 caspase-9前體發生免疫共沉淀，由此推斷 livin可以通過抑制caspase-3及caspase-9的活性而抑制細胞發生凋亡，且caspase-3是caspases家族中最重要的凋亡效應蛋白，它的激活是凋亡信號轉導的關鍵。向燕群［10］等人使用抗癌藥拓撲異構酶Ⅱ(TopoⅡ)抑制劑吡喃阿霉素(THP)、阿霉素(ADM)誘導鼻咽低分化鱗癌細胞株 SUNE-1細胞凋亡，藥物作用24 h后，SUNE-1細胞凋亡率增加，流式細胞儀檢測livin表達水平增高，這就說明癌細胞表達livin是一種抗凋亡的防御機制。Crnkovic＇-Mertens等人［11］利用 RNAi技術特異性沉默Hela細胞的livin基因，癌細胞凋亡率增加且對抗癌藥物和TNF-α的敏感性增加，且caspase-3，7，9的活性增加。本次實驗研究表明livin表達下調可以有效地促進細胞中caspase-3活性的增加，實驗組細胞凋亡率達到22.6%，約為空白組細胞凋亡率的6倍。MTT檢測細胞增殖活性結果顯示，實驗組細胞生長明顯受到抑制，抑制率最高達38.7%。

本實驗研究證實，livin靶向RNA干擾增強了CNE-2Z細胞caspase-3的活性，增加了鼻咽癌細胞凋亡率，抑制了鼻咽癌細胞的增殖能力，提示livin基因可作為鼻咽癌治療的新靶點。

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