單寧酸對糖尿病大鼠腎組織和腎小球系膜細胞培養上清中8-OHdG及3-NT含量的影響①

魏海峰 劉 磊 蘆小單 米旭光 李首慶 譚 巖 方艷秋

(吉林省人民醫院中心實驗室，吉林省生物治療與基因診斷重點實驗室，長春 130021)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)發病率逐年升高，現已成為全球日益關注的公共健康問題。長期高血糖狀態下糖尿病個體可以引發各種糖尿病慢性并發癥，其中，糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常見和最嚴重的并發癥之一。DN的發病機制尚未完全闡明，且缺乏有效的治療方法。近年來，隨著糖尿病并發癥統一發病機制廣泛被接受，氧化應激、亞硝基化應激與DN發病的關系已成為DN研究領域新的課題。機體內氧化應激機制十分復雜，除了氧自由基本身可以導致機體損害以外，活性氧(ROS)與活性氮(RNS)生成的過氧亞硝基陰離子(ONOO－)也可以產生更強的毒性效應。ONOO－能與游離的酪氨酸或蛋白質中的酪氨酸殘基發生反應，使酪氨酸硝化產生3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)［1］。3-NT 是體內 ONOO-生成的特異性標志物，其含量可以代表組織內亞硝基化應激的水平。目前ONOO-對機體的損傷作用已引起廣泛關注，但有關亞硝基化應激與DN發病的關系尚很少有報道。

祖國傳統中醫藥在DM及其并發癥的防治上具有獨特的優勢，我國藥典上收載的單寧酸(Tannic acid，TA)具有多方面的生理活性，尤其具有顯著的抗炎、抗氧化、降糖降脂、抗腫瘤等作用。我國擁有豐富的提取制備單寧酸天然資源，約70%以上的中草藥、多種樹木及果實中均含有此類鞣質化合物。但目前國內外關于單寧酸對DN的防治作用的研究報道很少。因此本研究通過動物實驗觀察單寧酸對DM模型大鼠腎臟形態和功能影響并在組織和細胞水平探討糖尿病引起機體的氧化應激、亞硝基化應激機制及單寧酸的改善作用，為單寧酸防治DN提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 鹽酸氨基胍(AG)及單寧酸(TA)均購自 Sigma公司，注射前用0.1 mol/L的PBS溶液配制2%氨基胍溶液及1%單寧酸溶液，以NaOH調整溶液的pH值為7.0，超凈臺下用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌備用;將牛血清白蛋白(組分Ⅴ)10 mg/ml、葡萄糖 0.5 mol/L、EDTA 1 mmol/L、青霉素100 U/ml和鏈霉素100 μg/ml溶于 pH7.2 PBS，過濾除菌，37℃恒溫避光孵育2個月，透析除糖后制備糖化牛血清白蛋白(AGEs)，同樣條件下孵育的不含葡萄糖牛血清白蛋白(BSA)作為陰性對照。DMEM培養基(Gibco)，小牛血清(FBS，天津灝洋生物技術有限公司)，胰蛋白酶(Gibco)，大鼠8-OhdG及3-NT試劑盒(美國RND公司)，CO2培養箱(SHEL-LAB)，XSB-1A倒置生物顯微鏡，DG5031型酶聯免疫檢測儀。大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1，由吉林大學基礎醫學院病理生理學教研室惠贈。

1.2 動物實驗 健康雄性Wistar大鼠68只(由吉林大學實驗動物中心提供)，體重(190±12)g，6周齡。常規飼料適應性飼養1周后，隨機選取8只作為正常對照組，其余60只給予高糖高脂飼料喂養，4周后造模，造模前禁食12 h，正常對照組大鼠腹腔注射等體積0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液，其余大鼠用鏈脲佐菌素(STZ，購自Sigma公司)按52 mg/kg體重(使用前用0.1 mol/L、pH4.2無菌檸檬酸鹽緩沖液配成2%溶液)單次腹腔注射，72 h后監測血糖、尿糖，尿糖+++以上及尾靜脈隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病成模標準。將造模成功的大鼠進一步隨機分為模型組、氨基胍組、單寧酸低劑量組、單寧酸高劑量組，每組15只。給藥方法:氨基胍組及單寧酸低高劑量組分別腹腔注射AG［40 mg/(kg·d)］及TA［20及30 mg/(kg·d)］，正常對照組和模型組給予生理鹽水［30 mg/(kg·d)］，為期10周。實驗期間動物自由進食飲水，未使用胰島素及其他降糖藥物。實驗結束時處死動物，眼球取血，2000 r/min離心10 min，吸取血清分裝于 Eppendorf管中，－20℃冰箱保存備用。摘取腎臟，左右腎去除包膜，生理鹽水洗去血跡后稱重，用鋒利刀片將腎臟自腎門處冠狀切面對半剖開，一半分裝入標本袋，立即放入液氮中速凍，而后－80℃保存備用。另一半腎臟放入4% 多聚甲醛中固定48 h，常規制備石蠟切片。

1.3 細胞培養 將大鼠GMC株接種于含10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的DMEM低糖培養基中，37℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養，細胞生長至亞匯合狀態時，更換為含0.5%FBS的DMEM低糖培養基繼續培養24 h，使細胞同步化。然后將細胞分為以下幾組:正常糖組(Normal glucose，NG)，含 5.6 mmol/L D-葡萄糖;高糖組(High glucose，HG)，含 30 mmol/L D-葡萄糖;甘露醇組，含25 mmol/L甘露醇;AGEs及BSA組:將AGEs或BSA加入低糖 DMEM培養液中，使AGEs及BSA終濃度為250 mg/L;藥物處理組:在高糖或AGEs處理的同時加入藥物，單寧酸(TA)分為10、20、40 及 80 μmol/L 4 個濃度組;氨基胍(AG)作為陽性對照藥，終濃度為250 μmol/L。給藥后繼續培養48 h，留取細胞培養上清。

1.4 觀察指標及方法

1.4.1 腎臟形態學觀察 常規進行腎臟HE染色，光鏡下觀察腎小球大小、結構、系膜細胞數量、系膜基質增生情況等。

1.4.2 腎臟功能測定 采用日立7150型全自動生化儀檢測各組大鼠血清肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)、尿酸(UA)水平及尿蛋白(Urine protein)，計算24 h尿蛋白排泄量。

1.4.3 腎組織勻漿8-OHdG及3-NT含量測定 雙抗體夾心法，按照試劑盒說明書操作。

1.4.4 細胞培養上清中8-OHdG及3-NT含量測定同上。

2 結果

2.1 單寧酸對糖尿病大鼠腎臟形態的影響 光鏡下見正常對照組大鼠腎小球無明顯異常，系膜細胞和系膜基質無明顯增生，毛細血管袢開放，腎小球囊無滲出及粘連，腎間質無明顯炎細胞浸潤，腎小管結構正常。DM模型組腎小球體積增大，系膜基質增多，部分毛細血管受壓而塌陷，腎小管管腔擴張，上皮細胞空泡變性。單寧酸處理組較DM模型組有很大程度改善，腎小球體積增大不明顯，僅有輕度系膜增生，絕大多數毛細血管腔開放，見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟HE染色比較(×400)Fig.1 Comparison of HE staining of rat kidney in different groups( ×400)

2.2 單寧酸對糖尿病大鼠腎臟功能的影響 各組DM大鼠血清Cr、BUN、UA含量和24 h尿蛋白排泄量均明顯高于對照組，單寧酸處理10周后的DM大鼠，血清Cr、BUN和尿蛋白排泄量均不同程度改善，見表1。

表1 各組大鼠腎功能生化指標(，n=6)Tab.1 Biochemical parameters of renal function in different groups(，n=6)

表1 各組大鼠腎功能生化指標(，n=6)Tab.1 Biochemical parameters of renal function in different groups(，n=6)

Note:Compared with Control group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;Compared with DM group，3)P ＜0.05，4)P ＜0.01.

Groups Cr(μmol/L)BUN(mmol/L)UA(μmol/L)Urinary protein(mg/24 h)Control 66.00±5.74 4.76±1.38 62.20±7.76 8.67±1.90 DM 134.36±18.222)16.60±4.042)106.52±14.022)27.20±3.462)AG 109.40±15.962)12.30±3.232)88.40±11.671)18.95±3.222)4)TA20 105.40±14.992)3)10.86±1.971)3)85.18±8.301) 22.31±2.222)TA30 93.70±9.771)4)11.00±1.731)3)90.34±14.782)21.17±2.972)3)

2.3 單寧酸對糖尿病大鼠腎組織勻漿8-OHdG含量的影響 正常對照組大鼠腎組織8-OHdG含量較少;DM模型組大鼠腎組織8-OHdG含量較正常對照組明顯增多(P＜0.01);低劑量單寧酸處理組(TA20)大鼠腎組織8-OHdG含量與DM模型組比較，減少不明顯，無統計學意義;而高劑量單寧酸處理組(TA30)大鼠腎組織8-OHdG含量較DM模型組明顯減少(P＜0.05)，具有統計學意義，且與正常對照組比較無明顯差別(P＞0.05)，見表2。

表2 大鼠腎組織勻漿中8-OHdG及3-NT含量(，n=3)Tab.2 Contents of 8-OHdG and 3-NT in nephridial homogenate of rats(，n=3)

表2 大鼠腎組織勻漿中8-OHdG及3-NT含量(，n=3)Tab.2 Contents of 8-OHdG and 3-NT in nephridial homogenate of rats(，n=3)

Note:Compared with Control group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;Compared with DM group，3)P ＜0.05.

Groups 8-OHdG(ng/L) 3-NT(nmol/L)Control 22.63±8.66 75.94±16.79 DM 54.22±7.992) 118.63±4.572)AG 47.40±5.902) 93.31±13.823)TA20 40.96±9.331) 97.91±5.281)TA30 33.18±12.113) 94.51±13.603)

2.4 單寧酸對糖尿病大鼠腎組織勻漿3-NT含量的影響 由表2可以看出，DM模型組大鼠腎臟組織3-NT含量較正常對照組明顯增多(P＜0.01)，與DM模型組相比，氨基胍組(AG)和高劑量單寧酸處理組(TA30)大鼠腎組織3-NT的含量明顯減少(P＜0.05)，與對照組無明顯差別(P＞0.05)。

2.5 單寧酸對GMC培養上清中8-OHdG含量的影響

2.5.1 單寧酸對高糖培養GMC培養上清中8-OHdG含量的影響 正常糖組培養上清中氧化應激標志物8-OHdG含量較少，高糖組8-OHdG含量較正常糖組明顯增多(P＜0.01);氨基胍及單寧酸組培養上清中8-OHdG含量較高糖組有所減少，其中80 μmol/L單寧酸組8-OHdG含量顯著減少，與高糖組比較具有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表3 高糖培養條件下GMC培養上清中8-OHdG及3-NT含量(，n=3)Tab.3 Contents of 8-OHdG and 3-NT in supernatant of GMC cultured in high glucose conditions(，n=3)

表3 高糖培養條件下GMC培養上清中8-OHdG及3-NT含量(，n=3)Tab.3 Contents of 8-OHdG and 3-NT in supernatant of GMC cultured in high glucose conditions(，n=3)

Note:Compared with NG group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;compared with HG group，3)P ＜0.05.

Group Dose(μmol/L) 8-OHdG(ng/L) 3-NT(nmol/L)NG 43.02±3.95 88.49±8.34 HG 57.11±5.302) 120.82±6.272)HG+AG 250 53.35±3.291) 110.86±5.621)HG+TA 10 56.47±2.502) 114.67±6.032)20 49.70±2.64 102.16±13.603)40 51.16±6.68 105.98±14.461)80 48.34±6.363) 100.61±8.793)

表4 AGEs培養條件下GMC培養上清中8-OHdG及3-NT含量(，n=3)Tab.4 Contents of 8-OHdG and 3-NT in supernatant of GMC cultured in AGEs conditions(，n=3)

表4 AGEs培養條件下GMC培養上清中8-OHdG及3-NT含量(，n=3)Tab.4 Contents of 8-OHdG and 3-NT in supernatant of GMC cultured in AGEs conditions(，n=3)

Note:Compared with BSA group，1)P ＜ 0.05，2)P ＜0.01;compared with AGEs group，3)P ＜0.05，4)P ＜0.01.

Group Dose(μmol/L) 8-OHdG(ng/L) 3-NT(nmol/L)BSA 47.57±2.41 94.05±10.28 AGEs 61.97±6.992) 117.38±13.622)AGEs+AG 250 53.88±3.253) 104.52±8.41 AGEs+TA 10 57.43±3.022) 109.75±2.831)20 55.79±2.781) 110.30±4.671)40 52.81±3.233) 98.86±7.833)80 52.44±3.584) 101.61±9.773)

2.5.2 單寧酸對AGEs培養條件下GMC培養上清中8-OHdG含量的影響 BSA對照組細胞培養上清中8-OHdG含量較少，加入200 mg/L的AGEs刺激后，細胞培養上清中8-OHdG含量較BSA組明顯增多(P＜0.01);氨基胍及單寧酸處理組8-OHdG含量均顯著減少，與AGEs組相比具有統計學意義。可見單寧酸可以減少AGEs引起的細胞氧化應激增加，且這種作用呈一定濃度依賴性，見表4。

2.6 單寧酸對GMC培養上清中3-NT含量的影響

2.6.1 單寧酸對高糖培養條件下GMC培養上清中3-NT含量的影響 高糖培養條件下GMC培養上清中3-NT含量增多，與正常糖組比較差異具有統計學意義(P＜0.01)，提示高糖條件下細胞亞硝基化應激水平增高。與高糖組比較，單寧酸處理組細胞培養上清中3-NT含量明顯減少，其中20、80 μmol/L單寧酸組3-NT含量較高糖組明顯減少(P＜0.05)，見表3。

2.6.2 單寧酸對AGEs培養條件下GMC培養上清中3-NT含量的影響 AGEs刺激可增加GMC培養上清中3-NT含量，與BSA對照組比較差異具有統計學意義(P＜0.01);單寧酸處理組培養上清中3-NT含量較AGEs組有所減少，其中40 μmol/L和80 μmol/L單寧酸處理組3-NT含量與AGEs組比，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

3 討論

單寧酸在藥典上又稱鞣酸、鞣質、五倍子單寧酸，是一類復雜的高分子多元酚類化合物，由于單寧酸的分子量比較大，其成分在植物中存在相當復雜，往往同一植物內同時存在不同結構而性質相近的各種單寧酸，加之其化學結構大多不穩定，給中藥制劑的提純、液體藥劑的澄明度都帶來很多麻煩。在多數情況下，一般都作為雜質除去。近年來，由于天然有機化合物分離、精制技術的提高，藥理實驗動物模型的不斷出現，逐漸成熟，大量研究不僅闡明了千余種新的單寧酸化合物結構，而且發現單寧酸具有多方面的藥理作用。除常見的收斂、抗菌消炎、止血、驅蟲、止瀉、抗多種病原體感染外，還表現出抗腫瘤、抗突變、抗脂質過氧化、抗變態反應及降壓、降脂、改善肝腎功能等作用［2，3］。本研究結果顯示，單寧酸可有效改善糖尿病大鼠腎組織病理改變及改善腎功能，從而延緩DN的發生和進展。

大量動物實驗和臨床研究表明，采取抗氧化治療可以有效延緩DN的發生和發展。除了常用的抗氧化型維生素C和維生素E、GSH、ACEI和ARB類藥物外，許多中藥也具有抗氧化活性。單寧酸的多元酚類結構賦予它一系列獨特的化學性質，使其成為一類重要的天然活性物質，其中最引人注目的是它在抗氧化和清除自由基方面表現出的比其他抗氧化劑更強的活性。周本宏等［4］研究發現，石榴皮中提取的單寧酸對羥自由基和超氧陰離子自由基均具有較好的清除作用，較低濃度時即可發揮清除作用。王川［5］探討葡萄籽單寧在體外對油脂的抗氧化和清除活性氧自由基的能力，并與一些天然抗氧化劑作比較。結果表明葡萄籽單寧的抗氧化能力效果強于檸檬酸和維生素C。本次研究結果表明，單寧酸可以減少大鼠腎組織8-OHdG水平。因此我們推測，單寧酸對DM大鼠腎臟病變的改善作用，可能是通過清除大鼠腎組織內氧自由基，提高抗氧化酶的活性，從而降低大鼠體內氧化應激水平而實現的。

過氧亞硝基陰離子(ONOO－)是一種很強的細胞毒性物質，是一種強氧化劑和硝化劑，能以多種方式對機體產生細胞毒作用。在氧化、過氧化、亞硝基化等綜合作用下可以引發脂質過氧化、蛋白質損傷、酶失活、DNA損傷、細胞膜和線粒體膜變性及小分子抗氧化劑的損耗等［6-8］。ONOO－引發體內白質酪氨酸殘基的硝化，產生3-硝基酪氨酸(3-NT)。在正常生理條件下，也可發生酪氨酸殘基的硝化反應，而病理條件下3-NT的水平通常會升高。目前已在50多種疾病的病變組織或體液中檢測到3-NT的存在［9-11］。研究發現ONOO－可損傷胰島β細胞，因此認為 ONOO－可能是糖尿病發病的一個重要因素［12］。齊錦生等［13］在DM大鼠骨及體外高糖培養的成骨細胞(OB)中檢測到iNOS及ONOO－的高表達，提示ONOO－的增加可能是造成糖尿病骨質疏松的機制之一。Xiao等［14］研究發現鏈脲佐菌素誘導的糖尿病模型大鼠的腎臟TNF-α水平、NO含量、iNOS表達及3-NT含量均顯著增加，氨基胍可作為ONOO－清除劑改善糖尿病組大鼠的腎小球病變及腎功能。本研究在DM大鼠腎組織中檢測到3-NT含量增高，也證明了機體內活性氧和活性氮生成過量ONOO－，進而硝化蛋白質酪氨酸殘基可能是DN發病的另一重要原因。體外實驗結果發現，在高糖及AGEs誘導下，GMC細胞培養上清中也檢測到過量的硝基應激標志物3-NT，在細胞水平驗證了這一結論。

近年來ONOO－在各種疾病發病中的作用及損害程度受到重視，如何對抗ONOO－引起的損傷已引起了廣大學者的廣泛關注。目前對抗ONOO－的方法主要有防止、清除及修復三種。最新的國外研究表明，采用ONOO－清除劑或蛋白質硝化抑制劑可有效改善糖尿病的外周血管和神經病變［15，16］。本實驗檢測到單寧酸處理組培養上清中3-NT含量較高糖組及AGEs組明顯減少，推測可能是單寧酸通過提高抗氧化酶的活性，抑制O2的生成，或者通過抗炎作用，抑制NO和O2生成過量的ONOO－，進而抑制蛋白質被過度亞硝基化。具體的作用機制需要進一步在體外實驗及分子水平的研究中進行驗證。總之，加強對ONOO-引起組織或細胞損傷的基礎研究，特別是開展針對抗ONOO－損傷作用和有效清除體內ONOO－的新藥開發，將有助于進一步揭示DN發病的分子機制，為臨床防治DN提供新的策略。關于單寧酸是一種有效的抗氧化劑的報道較多，本次試驗發現單寧酸也可顯著減少糖尿病模型大鼠腎組織勻漿及體外高糖或AGEs刺激的腎小球系膜細胞培養上清中3-NT含量，說明單寧酸也是一種有效的抗硝化劑。

亞硝基化應激與氧化應激密切相關，單寧酸可以同時降低機體氧化應激和亞硝基化應激水平，進一步證明單寧酸是一種作用明顯的抗氧化劑和抗硝化劑。單寧酸具有腎臟保護作用，推測與其提高糖尿病大鼠的抗氧化能力，降低糖尿病大鼠的亞硝基化應激水平有關。中藥治療糖尿病具有悠久的歷史，正確應用現代藥理學方法，深入系統地研究中藥防治糖尿病及其并發癥的有效物質及作用機制，是推進中藥現代化進程的重要工作。單寧酸資源豐富，藥理活性多，在防治糖尿病及其并發癥方面具有較好的應用前景。

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