流式細胞術檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的方法學探討①

陳東亞 陸羅定 俞 萍 卞 倩 徐 軍 楊明晶

(江蘇省疾病預防控制中心，毒理與功能評價所，南京 210009)

巨噬細胞是固有免疫系統的重要成員，具有吞噬、清除及呈遞抗原異物的生物學功能，是維持機體的正常生理狀態所必需的［1］。傳統的顯微鏡鏡檢記數法檢測巨噬細胞吞噬能力存在主觀性強、重復性差及耗時長等缺點，影響實驗結果的客觀性與準確性。流式細胞儀技術用于巨噬細胞的吞噬率檢測可以輕易地將觀察細胞數從幾百上升至幾千，而且具有分析速度快、重復性好和特異性強等優點。熒光微球被細胞吞噬后，其熒光信號可迅速被流式細胞儀檢測，具有熒光信號的巨噬細胞即視為出現吞噬現象，可快速、準確地測定巨噬細胞的吞噬率［2-5］。《保健食品檢驗與評價技術規范增強免疫力功能評價方法(征求意見稿)》中要求用小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球試驗替代巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗［6］，本研究的主要目的是在征求意見稿的基礎上，摸索最佳實驗條件，從而使該方法能靈敏、穩定的反映小鼠腹腔單核-巨噬細胞吞噬能力。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SPF級ICR小鼠，18～22 g，5～6周齡，雌性，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物生產許可證:SCXK(滬)2012-0002;羧酸鹽修飾熒光微球(F8827)為美國Invitrogen產品;牛血清白蛋白(Bovine serum albumin fractionⅤ，BSA)為美國AMERSCO公司產品，無支原體新生小牛血清為浙江天杭生物科技有限公司產品;Hank’s液為Gibco產品;PBS為實驗室自行配制;流式細胞儀(BD Accuri?C6)為美國Becton Dickinson公司產品;金葵素膠囊(Jinkuisu capsule，JKS)由江蘇蘇中藥業集團股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 預調理熒光微球 取熒光微球與1%BSA以1∶100體積比混勻，微球濃度為4.5×106個/ml，37℃避光孵育30 min，超聲處理5 min，臨用前配。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬細胞的制備 實驗前4 d給每只小鼠腹腔注射0.2 ml 2%綿羊血紅細胞以激活小鼠巨噬細胞。實驗當天用頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射加5%小牛血清的Hank＇s液5ml/只，輕輕按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬細胞，然后將腹壁剪開一個小口，吸取腹腔洗液2 ml用75 m(200目)過濾器過濾至試管內，經計數，腹腔巨噬細胞數為2 ×105～4 ×105ml－1。

1.2.3 吞噬實驗

1.2.3.1 不同細胞濃度、微球濃度、孵育時間的摸索 三塊六孔板，上排每孔加1 ml制備的腹腔原液，下排每孔加1 ml經Hank＇s液1∶1稀釋的腹腔液(巨噬細胞數為1×105～2×105ml－1)，每板第一列每孔加調理的熒光微球1.1 ml，第二列每孔加熒光微球2.2 ml，第三列每孔加3.3 ml，即微球濃度分別為5×106/孔、1×107/孔和 1.5×107/孔。分別于37℃二氧化碳細胞培養箱避光孵育1、1.5和2 h后，棄上清，每次使用2.0 ml 4℃PBS緩沖液輕輕洗滌2次，去上清后再加入4℃ PBS緩沖液0.5 ml，用細胞刮刮下貼壁細胞，輕輕吹打均勻后經75 m過濾器過濾后上機分析，實驗重復5次。

1.2.3.2 不同巨噬細胞消化方法 一塊六孔板，每孔加1 ml制備的腹腔原液和調理的熒光微球2.2 ml，于37℃二氧化碳細胞培養箱避光孵育1.5 h后，棄上清，每次使用2.0 ml 4℃PBS緩沖液輕輕洗滌2次，去上清后再加入4℃ PBS緩沖液0.5 ml，上排每孔加2 ml 0.25%Na2EDTA-胰酶消化液，下排每孔加2 ml 0.02%EDTA消化液，37℃消化30 min，棄消化液，上排加含5%小牛血清的Hank's液4 ml反復吹打，下排加不含血清的Hank's液4 ml反復吹打，收集細胞，1 500 r/min，5 min離心洗滌2次，重懸于0.5 ml 4℃ PBS緩沖液中，經75 m過濾器過濾后上機分析，實驗重復5次。

1.2.4 流式細胞儀檢測 先在FSC和SSC二維散點圖選取巨噬細胞區域，在FSC-H和SSC-A圖中去除粘連體細胞，然后再以SSC和FL2(FITC)直方圖檢測FITC陽性的巨噬細胞，以此視作吞噬熒光微球的巨噬細胞，檢測5 000個靶細胞，FITC陽性細胞比例即為巨噬細胞吞噬率(PP)，在直方圖中通過標尺標定未吞噬熒光微球的巨噬細胞群和吞噬熒光微球的巨噬細胞群，經軟件分析未吞噬熒光微球的巨噬細胞和吞噬不同數量熒光微球的巨噬細胞的比例。吞噬指數(PI)=被吞噬的熒光微球總數/巨噬細胞總數，其中，被吞噬的熒光微球總數=吞噬1個熒光微球的巨噬細胞總數×1+吞噬2個熒光微球的巨噬細胞總數×2+吞噬3個熒光微球的巨噬細胞總數×3+吞噬4個熒光微球的巨噬細胞總數×4+吞噬5個熒光微球的巨噬細胞總數×5，以此類推。

1.2.5 流式細胞術檢測金葵素膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 40只ICR小鼠隨機分成4組，分別為陰性對照組、247、495、1 485 mg/kg BW 金葵素膠囊處理組，金葵素膠囊取內容物用純凈水調配成受試濃度，灌胃容積為20 ml/kg BW，陰性對照組以等容積純凈水灌胃，連續灌胃30 d，按1.2.2方法獲取巨噬細胞，調整濃度至1×105～2×105ml－1，熒光微球濃度為1×107/孔，37℃孵育1 h后進行檢測。

1.2.6 雞紅細胞法檢測金葵素膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 按1.2.5方法進行分組和灌胃，按《保健食品檢驗與評價技術規范》2003年版增強免疫力功能中方法進行小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的檢測。

1.3 統計學分析 吞噬百分率需進行數據轉換，X=Sin－1，式中 P為吞噬百分率，所得數據經SPSS17.0單因素方差分析。

2 結果

2.1 巨噬細胞吞噬熒光微球實驗 流式細胞儀分析和數據獲取結果。圖1是流式細胞儀分析結果圖，圖1A為FSC和SSC單個細胞二維散點圖，R1為巨噬細胞，圖1B為FL2(FITC)直方圖，通過標尺標定吞噬熒光微球的巨噬細胞群。

2.2 不同細胞濃度、微球濃度、孵育時間對巨噬細胞吞噬率和吞噬指數的影響 由表1可見，微球濃度越高，吞噬率和吞噬指數越大;細胞濃度為1×105～2 ×105ml－1，孵育時間 1.5 h，微球濃度為 1.5 ×107/孔時吞噬率(PP)和吞噬指數(PI)最高(89.87%，1.54)，孵育至2 h時出現下降(57.71%，1.51);細胞濃度對吞噬率和吞噬指數的影響與熒光微球濃度呈負相關。

2.3 不同巨噬細胞消化方法對巨噬細胞吞噬率和吞噬指數的影響 貼壁巨噬細胞經胰酶加EDTA消化后PP為44.51%，PI為0.68，單獨使用EDTA消化后PP為37.92%，PI為0.57，均低于使用細胞刮刀處理組。

2.4 金葵素膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響 用流式細胞術法檢測金葵素膠囊對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響(表2)，可見灌胃30 d后，中、低劑量組吞噬率和吞噬指數與對照組比差異無統計學意義，但高劑量組吞噬率(PP)與對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05);雞紅細胞法檢測結果(表3)與流式法一致，說明流式細胞術法可以用于研究小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力，與傳統方法相比結果有一致性。

圖1 吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細胞FSC-SSC二維散點圖和FL2直方圖Fig.1 Dot-plot of FSC-SSC and histogram of FL2 of mouse peritoneal macrophages treated with fluorescent microspheres

表1 不同巨噬細胞濃度、不同微球濃度、孵育時間對巨噬細胞吞噬率和吞噬指數的影響()Tab.1 Effects of different concentration of peritoneal macrophages，fluorescent microspheres and incubation time on phagocytosis()

表1 不同巨噬細胞濃度、不同微球濃度、孵育時間對巨噬細胞吞噬率和吞噬指數的影響()Tab.1 Effects of different concentration of peritoneal macrophages，fluorescent microspheres and incubation time on phagocytosis()

Note:Compared with 5×106/well fluorescent microspheres，1 h group，1)P ＜0.05;compared with 2 h incubation time group，2)P ＜0.05;compared with 2 ×105 －4 ×105ml－1cell，1.5 h group，3)P ＜0.05.

Cell concentration Time/well 1.5×107 Concentration of fluorescent microspheres 5×106/well 1×107 PI 2×105－4×105ml－1 1 h 68.25±1.342) 1.20±0.21 73.98±1.972) 1.30±0.12 77.29±2.331)2)/well PP(%) PI PP(%) PI PP(%)8 57.71±1.68 1.51±0.13 1.35±0.15 1.5 h 73.47±1.872) 1.19±0.34 78.26±2.112) 1.26±0.18 80.63±1.342) 1.44±0.19 2 h 57.24±1.46 1.18±0.22 59.78±2.46 1.22±0.24 64.52±2.40 1.34±0.20 1×105－2×105ml－1 1h 72.06±1.162) 1.26±0.22 73.99±1.322) 1.25±0.23 77.04±1.242) 1.32±0.17 1.5 h 80.62±1.582) 1.35±0.21 82.57±2.102) 1.38±0.14 89.87±1.221)2)3)1.54±0.21 2 h 52.90±1.95 1.36±0.15 56.10±1.58 1.40±0.1

表2 流式細胞術法檢測金葵素對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響(，n=10)Tab.2 Effect of JKS on influencing phagocytosis of mouse peritoneal macrophages by flow cytometry assays(，n=10)

表2 流式細胞術法檢測金葵素對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響(，n=10)Tab.2 Effect of JKS on influencing phagocytosis of mouse peritoneal macrophages by flow cytometry assays(，n=10)

Note:Compared with control，1)P ＜ 0.05.

JKS/mg/kg PP(%)PI 1.18±0.15 Control 72.41±2.13 0.98±0.13 247 74.58±3.43 1.05±0.21 495 75.47±2.86 1.16±0.22 1 485 89.26±3.781)

表3 雞紅細胞法檢測金葵素對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響(，n=10)Tab.3 Effect of JKS on influencing phagocytosis of mouse peritoneal macrophages by chicken red blood-cell method(，n=10)

表3 雞紅細胞法檢測金葵素對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響(，n=10)Tab.3 Effect of JKS on influencing phagocytosis of mouse peritoneal macrophages by chicken red blood-cell method(，n=10)

JKS/mg/kg PP(%)PI Control 16.70±3.40 0.26±0.16 247 17.60±7.71 0.28±0.13 495 22.10±7.25 0.33±0.11 1 485 24.20±6.301)0.36±0.11

3 討論

本研究在征求意見稿的基礎上經多次實驗，摸索了可能影響吞噬率和吞噬指數的實驗條件:巨噬細胞濃度、微球濃度、孵育時間及酶消化方法。

實驗發現，熒光微球的濃度對吞噬率有一定程度的影響，微球濃度越高，吞噬率越高。可見巨噬細胞的吞噬能力很強，不易達到飽和。但熒光微球濃度過高會增加實驗成本，故而從經濟角度出發，選用1×107/孔即已足夠。

2 ×105～4 ×105ml－1和1 ×105～2 ×105ml－1兩個濃度的巨噬細胞在1 h時吞噬率無顯著性差異，但當細胞濃度1×105～2×105ml－1，微球濃度1.5×107/孔，孵育1.5 h時吞噬率與2×105～4×105ml－1組有顯著性差異，分析原因:1.5 h孵育結束時，由于2×105～4×105ml－1組細胞數過多，未稀釋的巨噬細胞組6孔板上清漂浮一層粘附有熒光微球的巨噬細胞，吸附在孔底的巨噬細胞沒有足夠的熒光微球吞噬，所以未稀釋的巨噬細胞的吞噬率低于低濃度的巨噬細胞。

小鼠腹腔巨噬細胞對熒光微球的吞噬率隨孵育時間的延長而增高，但1.5 h吞噬率達到最高，2 h時卻出現下降。與之前相關報道不一致［7］，推測可能是由于胞吞胞吐作用，吞噬了熒光微球的巨噬細胞排出了一部分熒光微球。但該理論還需要進一步論證。綜上可見1×105～2×105ml－1細胞濃度，1×107/孔微球濃度，孵育1 h，可使實驗快速而又精確的反應巨噬細胞的吞噬率。

由于使用細胞刮刀將貼壁細胞刮下時易造成碎片過多，易抱團等問題，故而嘗試使用酶消化法，但是試驗中發現巨噬細胞貼壁非常牢固，酶消化30 min無法充分消化，只能部分上清上機測試，導致吞噬率和吞噬指數偏低，不能準確反應巨噬細胞吞噬能力，且消化時間過長，操作步驟多，對于大批量樣本檢測有難度，所以不推薦使用酶消化法。另外，腹腔原液吸出后建議放入硬質塑料試管中，常用的1次性塑料軟試管巨噬細胞非常容易吸附，易導致細胞計數濃度和使用濃度相差太大，影響實驗結果。

綜上所述，流式細胞術法檢測巨噬細胞吞噬能力的方法是可行的，優化后能更快速、精確地反映巨噬細胞吞噬能力，與傳統雞紅細胞法相比結果具有一致性。后續研究需完善實驗方法，并進一步開發流式細胞儀在測定保健食品增強免疫力功能的應用。

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