Peroxiredoxin 2基因慢病毒載體的構建及對結直腸癌SW480細胞增殖的影響①

馮繼紅 傅仲學 文坤明 張壽儒 盧偉東 王 昊 吳星燁

(重慶醫科大學附屬第一醫院胃腸外科，重慶 400016)

結直腸癌是威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，在全球范圍內每年新發病例120萬例，死亡達60萬例［1，2］。目前結直腸癌在我國消化系統惡性腫瘤中列第2位，其發病和死亡呈逐年上升趨勢，且發病年齡有所提前［3］。隨著結直腸癌分子生物學發病機制研究的深入，特定分子靶向治療顯示出極大的臨床應用前景。

過氧化還原蛋白酶2(Peroxiredoxin2，Prdx2)是一種新近發現的分子量在20～30 kD的過氧化物酶家族成員之一，廣泛分布于生物有機體內，在哺乳動物組織細胞和亞細胞器中廣泛分布但又存在差異性。Prdx2功能多樣，具有抗氧化還原、介導細胞信號轉導、參與調節細胞周期及凋亡、調控免疫反應和發揮分子伴侶等功能。近年研究表明，Prdx2在多種腫瘤組織中表達，作為抑癌或促癌因子發揮重要作用［4，5］。我們前期實驗結果發現，Prdx2 在結直腸癌組織及細胞中表達明顯較高，提示Prdx2可能與結直腸癌的發展與轉移關系密切［6］。本實驗通過構建Prdx2基因的慢病毒表達載體，同時包裝高滴度慢病毒顆粒并轉染結直腸癌SW480，篩選建立穩定高表達Prdx2的SW480細胞株，同時檢測Prdx2在mRNA和蛋白水平的表達情況，并初步研究轉染Prdx2慢病毒表達載體的SW480細胞的增殖及生長變化，為進一步探討Prdx2基因對結直腸癌SW480細胞生物學行為的影響及其分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人結直腸癌SW480細胞株，購于中國生命科學院上海生命科學研究院細胞庫。Ubi-MCS-EGFP-IRES-Puromycin Vector(GV218載體)、AgeⅠ/AgeⅠ酶切、增強劑 Eni.S、polybrene(上海吉凱基因);Lipofectamine 2000(Invitrogen);In-FusionTMPCR Cloning Kit(clontech);Plasmid抽提Kit(QIAGEN);限制性內切酶、T4 DNA ligase(NEB);Taq polymerase(SinnBio);DNA Ladder(Fermentas);dNTP Mix(TaKaRa);瓊脂糖(賽百盛公司);瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化);FBS、BSA(上海微科生化試劑);DMEM、Leibovitz’s L-15培養基(Gibco);蛋白裂解液RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF(上海生物試劑廠);BCA蛋白含量試劑盒(凱基生物);PRDX2鼠抗人抗體(Abcam);GAPDH、HRP標記鼠二抗均購于(Santa Cruz);PCR儀(Applied Biosystems);Positive clone測序(美季生物技術);低溫臺式高速離心機和二氧化碳培養箱(Thermo);IX-51倒置顯微鏡和IX-71倒置熒光顯微鏡(Olympus)。

1.2 慢病毒載體的構建及鑒定 以Prdx2全長克隆(NM_005809)為模板擴增其編碼框序列，設計Prdx2基因引物序列，Prdx2正向引物序列為:GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC GCC ACC ATG GCC TCC GGT AAC GC;Prdx2反向引物序列為:TCA CCA TGG TGG CGA CCG GAT TGT GTT TGG AGA AAT ATT CC，引物含交換配對堿基、酶切位點，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR釣取目的基因。PCR方法釣取Prdx2基因后，將目的載體酶切，酶切產物電泳回收后交換入表達載體，其產物轉化細菌感受態細胞。對長出的克隆先進行菌落PCR鑒定，再對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和比對分析，比對正確即為構建成功的目的質粒。PCR反應條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 2 min，30個循環;72℃延伸10 min。PCR鑒定引物其正向序列Ubi-F:GGG TCA ATA TGT AAT TTT CAG TG;反向序列EGFP-N-R:CTG GTC GAG CTG GAC GGC GACG，產物大小:640 bp。同時設立陰性對照組(空載質粒為模板)和陽性對照組(插入GAPDH片段的載體組)，對假陽性和假陰性結果進行排除。對PCR陽性克隆片段測序鑒定，并在GenBank數據庫中將測序出的結果進行Blast比對。

1.3 慢病毒的包裝與病毒滴度測定 制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒及其兩種輔助包裝原件載體質粒(GV218慢病毒載體、pHelper1.0載體和pHelper2.0載體質粒)，三種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提，按 Invitrogen公司 Lipofectamine 2000使用說明進行共轉染293T細胞，轉染后8 h更換為完全培養基，培養48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，對其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，逐孔稀釋，滴度測定法實時定量PCR(qRTPCR)法測定其病毒滴度(TU/ml)。獲得攜帶增強綠色熒光蛋白基因(EGFP)和嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因的Prdx2慢病毒溶液(Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin)以及空載對照慢病毒(分別命名為 LVPrdx2、LV-Con)，病毒液分裝后于-80℃保存。

1.4 病毒轉染SW480細胞并篩選建立穩定表達Prdx2的細胞株 取細胞狀態良好，處于對數生長期的SW480細胞，計數后均勻接種于6孔板，分為3組:轉染組(SW480/LV-Prdx2)、空載慢病毒對照組(SW480/LV-Con)、陰性對照組(Negative control，NC)即未經任何處理的SW480組(SW480/NC)。待細胞完全貼壁、細胞匯合率達60%左右后進行轉染，依次加入終濃度為 8 μg/ml Polybrene、Eni.S、L-15培養基及稀釋的標準濃度病毒液(MOI為50)，使其總體積達1 ml。轉染作用時間約28 h后更換為含有3 μg/ml嘌呤霉素(Puromycin)的新鮮L-15培養液進行抗性篩選，轉染至48 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染效果。待細胞長滿后繼續在藥物選擇壓力下培養傳代3～4周建立SW480/LV-Prdx2穩定高表達Prdx2細胞株。

1.5 Western blot法檢測 收集SW480/LV-Prdx2組、空載慢病毒對照(SW480/LV-Con)組、陰性對照SW480細胞(SW480/NC)組，PBS洗滌2次，離心棄上清，加入200 μl預冷的RIPA細胞裂解液，置于冰上30 min，4℃、14 000 r/min 離心 16 min，取上清并進行蛋白定量(BCA法)。取30 μg蛋白加入上樣緩沖液，經100℃、10 min變性后用100 g/L的SDS-PAGE分離。蛋白半干轉移至PVDF膜，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉1 h，小鼠抗人Prdx2的一抗或小鼠抗人β-acin的一抗，4℃過夜，TBST洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加入ECL顯色劑后暗室內壓片曝光。

1.6 qRT-PCR檢測 各組細胞以Trizol法提取總RNA(按說明書操作)，瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA的完整性，逆轉錄反應合成Prdx2 cDNA，qRTPCR法擴增Prdx2和GAPDH。以各組細胞cDNA作為模板，每個組設立3個復孔。反應體系包括:2×SYBR Green Mix:10 μl，引物 Mix:1 μl ，模版:1 μl ，ddH2O:8 μl，總體系為20 μl。GAPDH 上游引物為:5’-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3’，下游引物為:5’-CAC CCT GTT GCT GTA GCC AAA-3’;Prdx2基因上、下游引物如前。PCR的反應條件:95℃ 2 min;95℃ 20 s;60℃ 30 s，72℃ 30 s(40 個循環)，反應完成后，得出Ct值，然后計算出相應Ct值，分析各組之間Prdx2基因的mRNA表達水平的差異。

1.7 MTT法檢測SW480細胞增殖抑制作用 取狀態良好，處于對數生長期各組細胞，消化后制成單細胞懸液，調整濃度為1×105ml-1，于96孔板內均勻接種細胞，每孔加L-15培養基200 μl，每組設5個復孔，另設陰性對照及空白對照孔，常規培養，每2 d換一次液;每天固定時間向每孔加20 μl MTT，37℃孵育 4 h;每孔加 150 μl DMSO，震蕩 10 min，酶標儀490 nm測吸光度(A)值，取5孔平均值。

1.8 克隆形成實驗 取轉染組及空載對照組的SW480細胞常規消化成單細胞懸液，以300個/ml均勻接種于6孔板。在CO2培養箱中培養，2～3 d更換一次新鮮培養基，培養2～3周，待細胞生長至肉眼觀察見有明顯克隆群落時取出結晶紫染色，在倒置顯微鏡下計數大于50個細胞的克隆數并拍照。克隆形成百分率按照下列公式計算:克隆百分率=克隆數/接種數×100%。

1.9 統計學分析 數據采用SPSS18.0進行統計學分析，各組數據采用表示，各組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒表達載體Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin的構建與酶切鑒定 據GV218載體(Ubi-MCS-EGFPIRES-Puromycin Vector)篩選陽性重組載體Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin，快速小量提取質粒DNA，經AgeⅠ/AgeⅠ雙酶切后得到一條明亮清晰的條帶，分子量大小約為11.1 kp，與 Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin片段大小一致，說明重組載體構建成功，見圖1A。目的基因Prdx2經PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳酶切后的產物，可見在640 bp大小處有明亮清晰的條帶，與設計的克隆片段大小一致，見圖1B。

Prdx2基因產物純化后轉接插入載體Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin后純化，大腸桿菌菌株 DH5α擴增慢病毒載體和輔助包裝載體質粒，并得到數十個克隆，挑取8個克隆(編碼為1～8號轉化子)，小量搖菌后行菌液鑒定，結果表明可擴增出約801 bp的目的片段，與目的條帶理論上大小相符的克隆可視為陽性克隆，PCR菌落篩選電泳結果見圖2。測序結果與GenBank NM_005809序列一致，說明重組載體Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin構建成功。

2.2 慢病毒載體的包裝與病毒滴度的測定 慢病毒載體共轉染293T細胞，于轉染48 h后在熒光顯微鏡下觀察其293T細胞發出的綠色熒光。經測定，慢病毒載體Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin(LV-Prdx2)濃縮后的病毒滴度大約為2×109TU/ml，空載對照慢病毒LV-Con濃縮后的病毒滴度則為2×108TU/ml。

圖2 陽性克隆PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant containing Prdx2 gene bacteria colonies

2.3 慢病毒轉染SW480細胞后熒光表達檢測SW480細胞轉染慢病毒Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin(LV-Prdx2)后48 h在熒光顯微鏡下觀察其綠色熒光表達，從明光視野和熒光視野二者比較中，可見其轉染效率較高，可達95%以上(圖3)。

圖3 轉染SW480細胞48 h熒光表達檢測(熒光顯微鏡，×200)Fig.3 Fluorescent observation of EGFP expression of SW480 cells 48 hours after virus infection(Fluorescent microscope，×200)

2.4 qRT-PCR檢測 qRT-PCR檢測結果顯示，與SW480/LV-Con組、空白組 SW480細胞比較，SW480/LV-Prdx2組細胞Prdx2 mRNA高表達，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖4。

圖4 各組SW480細胞中的Prdx2 mRNA表達Fig.4 Expression of Prdx2 mRNA in SW480 cells in three groups

2.5 Western blot法檢測 Western blot法檢測結果顯示，與陰性對照組及空載慢病毒對照(SW480/LV-Con)組相比，SW480/LV-Prdx2組細胞Prdx2蛋白呈高表達(圖5)。

圖5 Western blot法檢測LV-Prdx2轉染后SW480細胞中Prdx2的蛋白表達Fig.5 Protein expresstion of Prdx2 detected by Western blot analysis in SW480 cells transfected by LVPrdx2

2.6 Prdx2高表達對SW480細胞的促增殖作用MTT法檢測各組SW480細胞5 d OD值，繪制生長曲線，結果顯示，SW480轉染組細胞與對照組及空白組相比，生長增殖較快，差異具有顯著性(P＜0.05)(見圖6)。

圖6 MTT檢測高表達Prdx2對SW480細胞的促增殖作用Fig.6 Proliferation effect of over-expression of Prdx2 on SW480 cells by MTT

2.7 Prdx2對SW480細胞平板克隆形成能力的影響 細胞平板克隆形成實驗結果(見圖7)顯示，LVPrdx2組較空載對照組的平板克隆形成能力明顯升高(P＜0.05)。

圖7 Prdx2高表達對SW480細胞平板克隆形成能力的影響Fig.7 Effect of plate colonity in SW480 cells transfected by LV-Prdx2

3 討論

研究表明，近20%的人類癌癥是由轉染和炎癥疾病引起的，在這些疾病過程中激活的炎性細胞產生了大量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)。為了對抗ROS，細胞保護系統可直接破壞活性氧或是修復其造成的各種類型的損害，過氧化還原蛋白(Peroxiredoxins，Prdxs)在細胞對抗 ROS及保持胞內穩態的過程中發揮了極為重要的作用［7］。Prdxs家族是體內重要的抗氧化蛋白家族，廣泛存在于真核及原核生物中，哺乳動物細胞發現的6種Prdxs蛋白可分為3類:典型的2-半胱氨酸亞群(Prdx1～4)、非典型的2-半胱氨酸亞群(Prdx5)、1-半胱氨酸亞群(Prdx6)。Prdxs在清除ROS的過程中，自身也被氧化，隨后可通過合成新的蛋白質或在硫氧還蛋白及其他氧化還原劑的作用下再次恢復功能［8］。

Peroxiredoxin 2(Prdx2)作為Prdxs家族重要成員之一，除發揮抗氧化功能作用外，還通過過氧化氫(H2O2)介導的細胞因子信號轉導參與細胞的增殖、分化和凋亡［8］。Prdx2與機體的生長發育、細胞衰老、免疫功能密切相關，并在維持紅細胞生存，促進NK細胞發揮自然殺傷功能的過程中扮演重要角色［9，10］。另外，近年一個重要的發現就是Prdx2在不同的腫瘤中異常表達，通過不同的信號通路參與了腫瘤的發生、發展及轉移等。據報道，Prdx2與實體瘤如乳腺癌［11］、骨肉瘤［12］、肝癌［13］、膀胱癌［14］、前列腺癌［15］、黑色素瘤［16］等有關，是腫瘤重要生物標記物之一，但有趣的是Prdx2在乳腺癌、骨肉瘤、肝癌中其表達上調，可視為促癌因子，但在膀胱癌和黑色素瘤中表達降低，又被認為是抑癌因子，推測Prdx2在不同的腫瘤中可能通過不同的作用機制發揮調節作用。迄今為止，Prdx2在結直腸癌中的研究報道較少，我們前期實驗研究也證實Prdx2在結直腸癌組織及細胞株中表達上調，且與結直腸癌的發生、發展及轉移密切相關［6］，預測Prdx2可能在結直腸腫瘤組織中發揮更為關鍵的作用。根據本實驗結果，Prdx2對結直腸癌SW480細胞的增殖具有明顯促進作用，其作用的周期特點及涉及的分子作用機制仍需進一步深入。

綜上所述，本實驗通過構建可穩定高表達Prdx2的重組慢病毒表達載體Ubi-Prdx2-EGFP-Puromycin，并將其轉染結直腸癌SW480細胞，篩選建立穩定高表達Prdx2的SW480/LV-Prdx2細胞株，同時初步證實Prdx2的高表達可促進結直腸癌SW480細胞的增殖，為進一步研究Prdx2在結直腸癌中所發揮的功能及其作用機制提供實驗依據。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer Statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2012，62(1):10-29.

［2］American Cancer Society:Colorectal Cancer Facts＆ Figures［R］.Atlanta，Georgia:American Cancer Society，2011-2013.

［3］代 珍，鄭榮壽，鄒小農，等.中國結直腸癌發病趨勢分析和預測［J］.中國預防醫學雜志，2012，46(7):598-602.

［4］Zhang B，Wang Y，Su Y.Peroxiredoxins，a novel target in cancer radiotherapy［J］.Cancer Lett，2009，286(2):154-160.

［5］Neumann CA，Fang Q.Are peroxiredoxins tumor suppressors?［J］.Curr Opin Pharmacol，2007，7(4):375-380.

［6］Wu XY，Fu ZX，Wang XH.Peroxiredoxins in colorectal neoplasms［J］.Histol Histopathol，2010，25(10):1297-1303.

［7］Wood ZA，Schr?der E，Robin Harris J，et al.Structure，mechanism and regulation of peroxiredoxins［J］.Trends Biochem Sci，2003，28(1):32-40.

［8］Kang SW，Rhee SG，Chang TS，et al.2-Cys peroxiredoxin function in intracellular signal transduction:therapeutic implications［J］.Trends Mol Med，2005，11(12):571-578.

［9］Lee MS，Liu CH，Lee TH，et al.Association of creatin kinase B and peroxiredoxin 2 expression with age and embryo quality in cumulus cells［J］.J Assist Report Genet，2010，27(11):629-639.

［10］Tetsuro Ishii，Eiji Warabi，Toru Yanagawa.Novel roles of peroxiredoxins in inflammation，cancer and innate immunity［J］.J Clin Biochem Nutr，2012，50(2):91-105.

［11］Wang T，Tamae D，LeBon T，et al.The role of Peroxiredoxin II in radiation-resistant MCF-7 breast cells［J］.Cancer Res，2005，65(22):10338-10346.

［12］Kubota D，Mukaihara K，Yoshida A，et al.Proteomics study of open biopsy samples identifies peroxiredoxin 2 as a predictive biomarker of response to induction chemotherapy in ostesarcoma［J］.Proteomics，2013，8(91):393-404.

［13］Li Y，Qin X，Cui J，et al.Proteome analysis of aflatoxin B1-induced hepatocarcinogenesis in tree shrew(Tupaia belangeri chinensis)and functional identification of candidate protein peroxiredoxin II［J］.Protemics，2008，(7):1490-1501.

［14］Memon AA，Chang JW，Oh BR，et al.Identication of differentially expressed proteins during human urinary bladder cancer progression［J］.Cancer Detect Prev，2005，29(3):249-255.

［15］Masaki Shiota，Akira Yokomizo ，Eiji Kashiwagi，et al.Peroxiredoxin 2 in the nucleus and cytoplasm distinctly regulates androgen receptor activity in prostate cancer cell［J］.Free Radical Biology and Medicine，2011，51(1):78-87.

［16］Lee DJ，Kang DH，Choi YJ，et al.Peroxiredoxin-2 represses melanoma metastasis by increasing E-Cadherin/β-Catenin complexes in adherens junctions［J］.CancerRes，2013，73(15):4744-4757.