糖類抗原19-9單抗制備及DAS-ELISA的建立①

王云龍 翟晉豫 王繼創 程 蕾 李玉林 葛新杰 毛 烈

(河南師范大學生命科學學院，新鄉 453007)

1979 年 Koprowski等［1］以結腸癌細胞 株SW1116作為免疫原，獲得了多種特異性的單克隆抗體。其中經單克隆抗體1116-NS19-9特異性識別的抗原被命名為糖類抗原19-9(Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)。CA19-9是一種類黏蛋白形式的糖蛋白。同時也是多種癌癥檢測的重要參考指標之一［2-4］。研究表明，CA19-9針對胰腺癌、胃癌等有著良好的特異性及敏感性，針對胰腺癌相關檢測陽性率可以達到80%［5］。因此，建立CA19-9的檢測對于癌癥的臨床診斷具有重大意義。

作為CA19-9檢測試劑盒的重要組成部分，特異性的CA19-9單克隆抗體的制備顯得至關重要。但目前國內試劑盒所采用的CA19-9單克隆抗體多為國外公司生產，少數國內生產的單克隆產品在特異性、穩定性等方面尚有許多不足［6］，這嚴重影響了國產試劑盒的品質。本研究旨在探索利用新型免疫佐劑結合半固體培養法克隆化陽性雜交瘤細胞對單克隆抗體制備的意義，并利用制備獲得的單抗建立雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)方法，以此提升國產檢測試劑盒的性能。

1 材料與方法

1.1 主要材料 CA19-9抗原購于Fitzgerald Industries International公司。33份病患血清來自鄭州大學第一附屬醫院。Quick Antibody免疫佐劑購于北京康碧泉生物科技有限公司。8周齡左右雌性BALB/c小鼠購自鄭州大學醫學院實驗動物中心。SP2/0小鼠骨髓瘤細胞為本實驗室保存。PEG4000、HAT、HT、RPMI1640 培養基均購于 Gibco公司。辣根過氧化物酶(HRP)購于Sigma公司。HRP-兔抗鼠IgG由本實驗室制備。蛋白質Marker購于上海生工生物公司。小鼠亞型鑒定試劑盒為鄭州百基生物科技有限公司產品。CA19-9 ELISA檢測試劑盒為德國Roche公司產品。

1.2 方法

1.2.1 抗原免疫 免疫小鼠分為2組:A組將Quick Antibody佐劑與抗原等體積混勻，選取3只BALB/c雌性小鼠作為一組。另取1只小鼠注射等體積PBS溶液作為陰性對照。初次抗原免疫劑量為25 μg/只。2周后進行2次免疫，免疫劑量為25 μg/只。第3周采集尾血進行效價檢測。B組:采用弗氏免疫佐劑進行常規免疫，小鼠數目同A組。抗原免疫劑量為100 μg/只。1只對照小鼠注射等體積PBS溶液。共免疫3次，間隔周期為2周。A組免疫方式為肌肉注射，B組采用背部多點結合腹腔注射。7 d后采集小鼠尾血，測定血清效價。

1.2.2 間接ELISA檢測法的建立 利用棋盤篩選法進行操作。抗原稀釋成 0.25、0.5、0.75、0.1、0.15、0.2 μg/ml濃度，37℃包被 2 h，洗滌，以含 1%BSA的PBST封閉。小鼠血清1 000倍稀釋加樣，溫育30 min。洗滌、拍干。將酶標 IgG稀釋至1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000倍加入，溫育30 min，洗滌、拍干。加入TMB顯色，2 mol/L的硫酸終止，測定光吸收(OD)值。以陰性小鼠血清作為對照，設計3個復孔平行，依照P/N值最大確立最佳的抗原包被濃度及對應的酶標稀釋濃度。

1.2.3 阻斷ELISA法測定抗體的敏感性 CA19-9抗原按照0.5 μg/ml進行包被與封閉。同時將抗原進行倍比稀釋，與經檢測OD值接近1.0左右的小鼠稀釋血清50 μl等體積混合，同時設空白與陰性對照。設計3平行復孔，利用間接法檢測計算OD均值。以光吸收值在0.500左右、抗原濃度較低一組的小鼠作為融合備用小鼠。

1.2.4 細胞融合及單克隆抗體篩選 融合前調整SP2/0骨髓瘤細胞至對數生長期，選擇CA19-9小鼠血清抗體效價、敏感性高的小鼠作為融合用鼠進行細胞融合操作。收集SP2/0細胞，制備免疫小鼠脾臟細胞懸液。分別計數后，以1∶10的比例混勻，37℃條件下利用50%PEG4000進行促融。融合細胞用濃度為5 μg/ml的 HAT篩選培養基混勻，以2.0×106個 /ml密度鋪在含飼養層的96孔板中，37℃、5%CO2條件下培養至第3日半換液，第9日全部換液，利用間接ELISA法檢測培養孔中有無抗體分泌。

借鑒本實驗室任瑞敏等［7］文獻中半固體瓊脂克隆化篩選方法，利用RPMI1640配制1.1%的甲基纖維素培養基，并加入2.5 mmol/L L-谷氨酰胺、20%胎牛血清、1∶1 000青霉素-鏈霉素溶液混勻，取上述檢測陽性孔中細胞重懸至該半固體培養基中培養，待有肉眼可見細胞集落出現，利用毛細管克隆化陽性雜交瘤細胞。

1.2.5 小鼠腹水抗體效價檢測及亞型鑒定 小鼠腹腔注入陽性雜交瘤細胞收集腹水，利用間接ELISA測定該腹水效價，并采用辛酸硫酸銨法純化腹水抗體，紫外分光光度法測量OD值，并計算蛋白濃度。利用鼠亞型鑒定試劑盒對單克隆抗體進行亞型鑒定。

1.2.6 篩選配對抗體 采用改良過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶與單克隆抗體耦聯后，以病患血清為待測樣本，1 μg/ml包被3種單克隆抗體。加入1∶10稀釋定值病患血清后再加入1∶2 000倍稀釋的上述酶標抗體形成DAS-檢測方法，設計3平行復孔取OD均值，分析配對結果。

1.2.7 DAS-ELISA法的建立與特異性測定 利用棋盤法建立DAS-ELISA，包被抗體濃度分別取0.5、0.75、1、1.25、1.5、2 μg/ml進行包被。酶標抗體分別按照 1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000進行稀釋，二者依照DAS-ELISA 60 min-60 min-20 min反應模式進行。選取經賦值為1.0左右的陽性稀釋血清，以正常人血清在0.10左右為陰性，依據檢測結果，以陽性檢測結果值接近1.0，陰性對照低為最佳包被與酶標稀釋濃度。

利用上步構建的DAS-ELISA法對本實驗室已有的CEA、CA12-5、CA15-3高值特異性血清進行檢測，判斷有無交叉反應。

1.2.8 標準曲線的繪制 利用建立的DAS-ELISA檢測方法，選擇多濃度水平的定值病患血清作為檢測樣本，OD值為縱坐標，血清CA19-9抗原濃度為橫坐標，繪制標準曲線，判斷線性范圍。

1.2.9 DAS-ELISA法的應用 利用獲取的33份病患血清，通過本實驗構建的DAS-ELISA檢測方法與國外試劑盒進行對比檢測，比較二者相關性。

2 結果

2.1 間接ELISA檢測方法的確立 由棋盤法確定了抗原包被濃度為0.5 μg/ml，HRP-羊抗鼠IgG稀釋濃度為1∶6 000作為檢測的最優組合。

2.2 免疫效果對比及抗血清效價檢測 評價效果以陰性OD值2.1倍以上(不足0.05按0.05)判斷為能夠檢測到的效價水平。效價結果表明:A組2、3號小鼠與B組1、3號小鼠的效價度均達到1.28×106，其余2只小鼠的效價為3.2×104。A、B組免疫效果小鼠血清效價檢測值近似，說明Quick Antibody佐劑在節省抗原的基礎上，也能達到較高的抗體水平，見表1。

表1 小鼠抗血清效價檢測Tab.1 Determination titer of mice antiserum

2.3 多克隆抗體敏感性的檢測 多克隆抗體敏感性檢測結果如圖1所示。結果顯示，A組2、3號小鼠和B組1、3號小鼠的IC50值在0.16～ 0.63 μg/ml之間，抑制效果較好，產生多克隆抗體的敏感性值較高，此類小鼠適合作為融合小鼠。

2.4 細胞融合率及篩選得到陽性雜交瘤細胞 細胞融合進行了3次。經觀察克隆團形成孔統計數目，分別計算得出細胞融合的融合率為88.3%、83.9%和91.2%。通過對細胞克隆化上清間接ELISA法檢測，共獲得了7株可分泌抗體的陽性細胞株，2株后期轉陰，其余5株細胞株分別命名為ZJY1-2C8、ZJY2-3H9、ZJY2-7F10、ZJY3-4B6、ZJY3-1G9。后經細胞傳代穩定性等鑒定，最終確定3株較好 細 胞 株，分 別 為 ZJY1-2C8、ZJY2-7F10、ZJY3-1G9。

2.5 腹水效價檢測與單克隆抗體的純化及濃度測定 經間接ELISA法檢測，3株抗體的腹水效價均達到了106左右。經SDS-PAGE電泳，觀察到2條大小約為25 kD與55 kD的明顯條帶(如圖2)。單克隆抗體ZJY1-2C8的蛋白濃度約為14.7 mg/ml，ZJY2-7F10約為 17.1 mg/ml，ZJY3-1G9約為 12.8 mg/ml。

2.6 單克隆抗體亞型鑒定 利用小鼠亞型鑒定試劑盒對3株單克隆抗體進行亞型鑒定，結果:3株mAb均為IgG1型單克隆抗體。

2.7 配對抗體的篩選 篩選方法采用DAS-ELISA檢測方法，設計正交實驗，結果如表2所示。結果顯示:以ZJY3-1G9作為包被抗體、ZJY2-7F10作為酶標抗體時，測得的病患血清OD數值最高，說明兩者之間所識別的抗原表位不同，且距離稍遠，適合進一步實驗需要。

2.8 建立DAS-ELISA檢測法 利用棋盤法，將ZJY3-1G9作為包被抗體、ZJY2-7F10作為酶標抗體，檢測結果如表3。結果分析:當包被在1 μg/ml，酶標稀釋濃度為1∶6 000時，陽性值在1.0左右，陰性對照OD值為0.134較低，此包被與酶標為最佳。DAS-ELISA法檢測CEA、CA12-5、CA15-3均無交叉反應，證明配對抗體特異性較好。

圖1 小鼠多克隆抗體敏感性檢測結果Fig.1 Detection results from mouse polyclonal antibody reflects on sensitivities

表2 篩選配對抗體結果Tab.2 Results of antibody pairing test

表3 確定包被濃度及酶標抗體稀釋濃度Tab.3 Determination coating concentration of mAb and dilution of mAb-HRP

2.9 線性方程及范圍 經不同賦值的定值血清利用上步結果檢測出一系列OD值并做曲線。由圖4可見，抗原濃度在30～300 U/ml范圍中呈現線性關系，取此抗原濃度與對應OD值確定回歸方程:y=0.006 3x+0.069 7，R2=0.989 5。通過對樣品稀釋液進行20次重復檢測，依據均值±2SD值，確定最低檢測線為:26.4 U/ml。

2.10 DAS-ELISA檢測方法與國外試劑盒對比驗證

利用構建的DAS-ELISA檢測法與國外購買的試劑盒同時檢測33份病患血清，結果如圖3所示。在本實驗室條件下建立的DAS-ELISA檢測方法與國外試劑盒檢測對比結果顯示，兩者相關性良好，r=0.950 4，回歸方程:y=0.911 1x+2.076，R2=0.903 2。

3 討論

圖2 純化后抗體蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Results of SDS-PAGE with purified protein

圖3 CA19-9標準曲線Fig.3 Standard curve of CA19-9

圖4 DAS-ELISA檢測方法與國外試劑盒對比驗證結果Fig.4 Results of DAS-ELISA compared with Kits

眾多研究已表明:CA19-9是能夠針對胰腺癌、胃癌、宮頸癌等疾病診斷的一項腫瘤標記物［8-10］。目前臨床及研究使用的診斷試劑盒多為德國Roche、美國雅培等公司產品，國內生產試劑盒并不多見［11］。盧培等［12］利用兩株單克隆抗體配對進行光激化學發光免疫分析方法來探索應用與臨床的可行性，燕強奮［6］建立雙位點夾心免疫放射分析法來與法國CIS公司對比，相關系數r=0.896。前者雖選用的是國產單克隆抗體，但是未對其品質進行評價。后者選用國外單克隆抗體基本滿足了免疫分析要求，但效果并未凸顯。因此，獲得一對優異的配對抗體對提升CA19-9抗原的檢測水平，提升試劑盒品質至關重要。

本實驗應用新型免疫佐劑Quick Antibody對比常規免疫佐劑，縮短免疫周期，節省抗原使用量。同時配合使用半固體培養基法縮短獲取單克隆抗體時間［7］，在較高融合率保證的基礎下，最終獲得3株較好單克隆抗體，經配對實驗，建立完成DAS-ELISA檢測方法。在與國外試劑盒的檢測對比結果顯示相關系數r=0.950 4，具有良好相關性。但因實驗待測樣本量少，對結果會有一定影響，后期實驗主要需大量檢測樣本評價此方法的各方面性能指標。本實驗在提升CA19-9檢測試劑盒品質方面具有實際意義。

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