時間分辨熒光免疫分析法檢測心肌肌鈣蛋白Ⅰ方法學的建立及臨床應用①

張 潔 盧玲玲 潘曉夫 鄒立林 高基民

(溫州醫科大學檢驗醫學院生命科學學院，溫州 325035)

在中國，每年大約新發500萬例急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)，并呈快速增長的趨勢。AMI起病急，病死率高，隨著現代醫學手段的進步，AMI的致死率已從30%下降到10%，但仍大約有54萬的AMI患者在發病的第一周死亡［1］。因此尋找一個早期快速準確診斷AMI的心肌標志物刻不容緩。cTnI(cardiactroponin I，cTnI)是目前WHO推薦的急性心肌梗死早期診斷、疾病監測和預后評價的心肌標志物。肌鈣蛋白I(cTnI)是組成心肌肌鈣蛋白復合物的亞單位之一，具有高度的心肌特異性。快速、靈敏、準確測定人血中的cTnI對于診斷急性心肌梗死、急性冠狀動脈綜合征的危險分層、監測各種因素所導致的心肌損傷以及心臟事件的判斷預后等有著重要的意義［2］。

目前，檢測cTnI的方法有酶聯免疫吸附法。膠體金法。質譜法以及微粒子化學發光法等等。由于檢測方法的多樣性，因此尚未統一建立一個標準化的檢測系統，造成了不同醫院和實驗室之間的參考范圍不一致，結果不統一，延誤AMI的診斷和治療。建立一個統一的cTnI參考范圍以及標準化檢測系統是刻不容緩的。

時間分辨熒光免疫分析技術(Time resolved fluorescence immunoassay，TRFIA)是繼放射免疫技術、酶聯免疫吸附技術、免疫熒光技術和化學發光免疫技術之后的新一代免疫學診斷技術，它以鑭系元素稀土離子標記為特征，具有反應迅速、靈敏度高、信噪比低及無放射性污染等優勢，具有更寬的檢測線性范圍及更好的檢測性能。標準化的TRFIA檢測系統已經在白喉的毒素中和試驗以及風疹的疾病監控中作為標準方法［3-5］。

本文中，我們創建的時間分辨熒光免疫分析結合雙抗體夾心技術快速準確檢測血清中的cTnI，通過優化這一新型的TFRIA檢測系統并將其運用于臨床后，與心肌損傷的其他傳統診斷方法相比，具有操作簡單、靈敏度高和無放射性污染等優勢。

1 材料與方法

1.1 實驗標本 采集532份無抗凝劑的空腹血，37℃孵育15～30 min，凝固后3 000 r/min離心5 min，分離上清，保存至－80℃，待用。所有標本采集于2013年3月～7月瑞安市人民醫院和瑞安市中醫院，所有病人均告知《受試者知情同意書》。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑和儀器 牛血清白蛋白(BSA)，疊氮鈉(NaN3)及吐溫-20購自 Sigma-Aldrich.(St.Louis，MO，USA);鼠源的單克隆 cTnI抗體(catalog H86465M以及K31341G)以及cTnI標準品購自Meridian(Life Science，Inc.);SephadexG-50 購自 Pharmacia公司Eu3+標記試劑盒、Eu3+熒光增強液及PE2030型時間分辨熒光免疫檢測系統均購自Perkin Elmer公司產品;帶有濾膜的離心管購自Millipore公司。

1.2.2 固相包被抗體的制備 用碳酸鹽緩沖液抗cTnI單克隆抗體 H86465M 稀釋成 3 μg/ml，每孔100 μl加入到96孔板中，4℃孵育過夜。第二天從4℃ 冰箱中取出昨天包被的96孔板，傾去包被液，拍干;加入含有2%BSA的封閉液，每孔150 μl，室溫封閉2 h，傾去封閉液，拍干，鋁箔袋真空包裝，－20℃冷凍保存。

1.2.3 Eu3+標記抗體的制備和純化 標記前抗cT-nI單克隆抗體K31341G(1 mg，5.56 mg/ml)進行標記前純化處理，以除去磷酸鹽、疊氮鈉等干擾標記反應的物質，將螯合試劑加入到盛有待標記抗體K31341G的EP管中，混合均勻。置于冷庫環境中的搖床上孵育，4℃ 過夜(孵育時間至少14 h)。用Sephadex-50對樣品進行洗脫，蛋白檢測儀顯示出現蛋白峰時(約5 min)，開始收集樣品。根據280 nm蛋白的吸光度的高低選擇吸光度高的幾管合并，并用0.22 μm濾膜對目的產物進行過濾除菌。標記抗體的長期保存方法:將高純度的BSA加入到標記抗體溶液中，BSA終濃度為0.1%，4℃ 或－20℃ 保存。

1.3 分析性能評價

1.3.1 標記抗體穩定性 標記抗體分別在37℃保存7 d以及在4℃保存半年和一年。將cTnI標準蛋白稀釋成 6 個濃度(0、0.24、1.2、6.0、30.0、150 μg/L)來驗證標記抗體的穩定性。

1.3.2 標準曲線繪制 將cTnI標準蛋白稀釋成0 μg/L(A)，0.5 μg/L(B)，2.5 μg/L(C)，12.5 μg/L(D)，62.5 μg/L(E)以及312.5 μg/L(F)六個點，每個點測試5次，并由PE2030自帶軟件繪制成標準曲線。

1.3.3 空白及最低檢測限 空白及最低檢測限嚴格按照國際臨床化學標準委員會(NCCLS)的EP17-A程序進行檢測。空白檢測限使用的是無cTnI蛋白的血清標本;最低檢測限采用無AMI的患者血清，稀釋5倍后檢測。空白及最低檢測限檢測標本均分為兩個批次，檢測6次，連續5 d。

1.3.4 分析精密度 根據國際臨床化學標準委員會(NCCLS)的EP5-A2方案，分別用三個批次(標記為20121110、20130512和20131117)的試劑檢測血清中 cTnI高、中、低三個濃度(0.75 μg/L、3.75 μg/L和 187.5 μg/L)各3次/d，連續20 d，分別計算批內及批間的變異系數。

1.3.5 正常參考范圍 檢測300份無明顯臨床疾病的正常體檢血清標本(男∶女 =162∶138，年齡38.63±15.98歲，無X光，心電圖及血糖血脂的改變)，確定TRFIA法檢測cTnI的正常參考范圍。

1.3.6 方法學比較 將86份標本同時進行CLIA(微粒子電化學發光法chemiluminescent immun-oassay，CLIA，儀器 Architect I2000，試劑批號 Architect cTnI kit code 41059UN13)和TRFIA(時間分辨免疫檢測法)檢測，檢測結果進行線性回歸計算其相關系數。

1.3.7 臨床應用 通過對臨床上的cTnT，CK-MB(由CLIA法檢測)和心電圖以及治療前后cTnI(由TRFIA法檢測)的比較，驗證TRFIA法檢測cTnI的診斷及疾病監測效能。

1.4 統計學方法 所有的統計結果由SPSS18.0計算得到，P＜0.05認為具有統計學差異。

2 結果

2.1 Eu3+標記抗體的穩定性 試劑在37℃ 7 d以及在4℃半年或一年均保持穩定，見表1。

表1 標記抗體的穩定性Tab.1 Stability of antibody

2.2 空白及最低檢測限 所有的數據呈正態分布，空白檢測限(LoB)為 0.028 μg/L;最低檢測限(LoD)為 0.052 μg/L(計算公式:LoB:0.002 0 ±0.013 0，LoB=average+2SD;LoD:0.005 2 ±0.011 9，LoD=LoB+2SD)。

2.3 標準曲線及線性范圍 標準曲線:Y=7 485.878+1 400.924X，Y代表熒光值，X為cTnI濃度，相關系數為0.999，線性范圍為0.0～312.5 μg/L，見圖1。

2.4 精密度 高中低三個血清cTnI濃度的變異系數(CV)分別為:批號20121110為9.1%、9.2%和4.4%;批號20130512為7.1%、4.5%和3.6%;批號20131117為4.2%、6.2%和7.2%。批間變異系數分別為9.4%、8.8%和10%。批內以及批間的變異系數均符合中國體外診斷試劑的標準［6］。見表2、3。

2.5 參考范圍 檢測300例健康體檢病人得到的cTnI結果符合正態分布，其平均值為0.03 μg/L，標準差為0.055，得出TRFIA法檢測血清cTnI的95%可信區間為 ＜0.14 μg/L。將血清中 cTnI值大于0.14 μg/L的患者認定為cTnI陽性。見圖2。

表2 批內精密度Tab.2 Results of intra-assay precision

表3 批間的精密度(n=3×8)Tab.3 Results of inter-assay precision(n=3 ×8)

表4 TRFIA方法的敏感性和特異性Tab.4 Sensitivity and specificity of TRFIA

2.6 ROC工作曲線 為了繪制TRFIA檢測血清cTnI的ROC工作曲線，收集232份疑似AMI患者血清(男∶女 =118∶114，年齡18～86 歲，平均53.61 ±13.00歲)。結合臨床，共有197名患者確診為AMI。TRFIA的敏感性為96.45%，特異性為91.43%，準確度為95.69%，陽性預示值為98.45%，陰性預示值為82.05%。ROC的曲線下面積(AUC)為0.971。見表4、圖 3。

2.7 方法學比較 為了進一步驗證TRFIA法的臨床應用效能，收集86份患者血清，用TRFIA法以及臨床在用的CLIA法同時進行檢測。線性回歸結果顯示，兩者具有良好的相關，回歸方程為Y=0.727X+0.338(Y為CLIA法結果，X為TRFIA法結果)，相關系數為0.993。該結果顯示，我們新創的TFRIA法可用于臨床血清標本中cTnI的檢測，見圖4。

2.8 臨床的應用 與傳統用于診斷AMI的心電圖(Electrocardiography，ECG)［22］，肌酸激酶同工酶 MB(creatine kinase-MB，CK-MB)和 cTnT(cardiac-troponin T，cTnT)對比后顯示:TRFIA檢測的血清cTnI與上述三種指標沒有顯著差異，其P值分別為0.258、0.848和0.828。

圖1 TRFIA方法的標準曲線Fig.1 Standard curve of TRFIA method

圖2 參考范圍的正態分布圖Fig.2 Gaussian curve of reference values

圖3 TRFIA的ROC工作曲線Fig.3 ROC curve of TRFIA

圖4 CLIA和TRFIA方法比較的線性回歸圖Fig.4 Comparison between CLIA and TRFIA

表5 cTnI和ECG的比較Tab.5 Comparison between results of cTnI and ECG

為了驗證cTnI在監測疾病進程中的作用，我們收集了81例臨床確診的AMI患者的第1天及治療后第7天的血清標本，結果顯示:第1天患者血清中cTnI濃度為(111.76±57.03)μg/L，第7天的血清濃度為(1.81±1.31)μg/L，該結果具有顯著的統計學差異，提示TRFIA方法檢測的血清cTnI具有較好的疾病檢測作用。見表5。

3 討論

目前已有多種實驗室診斷方法應用于急性心肌梗死的臨床診斷。從檢測原理方面來看，基本上可分為熒光免疫分析法、放射免疫分析法、酶免疫分析法、化學發光免疫分析法和時間分辨熒光免疫分析法等。酶免疫分析法及化學發光免疫分析法現已應用于急性心肌梗死的臨床診斷。時間分辨熒光免疫分析法較目前使用的ELISA、化學發光免疫分析、膠體金分析等，具有更高的靈敏度和更寬的線性范圍，定量準確快速，從而對急性心肌梗死、輕微心肌缺血性損傷、不穩定性心絞痛和心肌炎等疾病做出更為準確的診斷，具有廣闊的產業化前景。

在本研究中，我們成功構建時間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)檢測肌鈣蛋白I(cTnI)。該檢測方法的標準曲線方程為Y=7 485.878+1 400.924X，劑量-反應線性相關系數為0.999，標準曲線檢測范圍是0.0～312.5 μg/L，檢測體系最低檢測量為0.052 μg/ml，穩定性試驗表明三批不同保存時間和條件的檢測用試劑相應的標準曲線未發生明顯偏移。TRFIA方法檢測cTnI標準品的批內精密度和批間精密度均＜10%，符合2010版《中國藥典》中有關體外診斷試劑的應用要求［6］。

通過對300例健康體檢人員血清標本的檢測結果確定TRFIA方法檢測cTnI的參考范圍，確立TRFIA方法檢測血清標本中cTnI陽性確認值為0.14 μg/ml。該陽性確認值比2003年魏景艷［7］采用酶聯免疫分析法(Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)檢測血清標本中cTnI濃度方法略低(其陽性確認值為0.8 μg/ml)，說明TRFIA方法具有較高的靈敏度。

通過TRFIA方法檢測健康體檢人員血清標本和急性心肌梗死患者血清標本，得出TRFIA方法的敏感性為96.45%，特異性為91.43%，準確度為95.69%;陽性預示值為98.45%，陰性預示值為82.05%。ROC的曲線下面積(AUC)為0.971，該數據較為理想，結果特異可靠，能應用于臨床，作為心肌損傷的特異性標記物。

通過比較81位急性心肌梗死治療前后的兩組血清標本，TRFIA方法檢測結果的差異明顯，P＜0.001，具有較好的AMI疾病監測價值。

目前檢測cTnI較好的方法是采用電化學發光免疫分析，靈敏度較高而且能較為準確地進行定量分析，但需要昂貴的儀器和試劑。時間分辨熒光免疫分析作為最靈敏的免疫學檢測方法，在許多免疫指標的檢測中較其他方法更具優勢:如更高的靈敏度、更寬的線性范圍，定量更精確等等。本試驗成功的構建了時間分辨檢測心肌肌鈣蛋白I方法并應用于臨床。

［1］Doug WJ，An J，Xing J，et al.Structural transition of the inhibitory region of troponin I within the regulated cardiac thin filament［J］.J Arch Biochem Biophys，2006，456(2):135-142.

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［3］MaplePA，Efstratiou A，George RC，et al.Diphtheria immunity in UK blood donors［J］.Lancet，1995，345:963-965.

［4］Maple PAC，Jones CS.Time-resolved fluorometric immunoassay for rubella antibody-a useful method for serosurveillance studies［J］.Vaccine，2002，20:1378-1382.

［5］Maple PAC，Gray J，Breuer J，et al.Performance of a time-resolved fluorescence immunoassay for measuring Varicella-Zoster virus immunoglobulin G levels in adults and comparison with commercial enzyme immunoassays and Merck glycoprotein enzyme immu-noassay［J］.Clin Vaccine Immunol，2006，13:214-218.

［6］中國藥物化學委員會.《中國藥典》體外診斷試劑規程2010版［M］.北京:中國醫藥科技出版社:2010:237-248.

［7］魏景艷，卜麗莎，童玉軍，等.心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體制備及酶免疫法的建立［J］.中華檢驗醫學雜志，2003，26(6):368-370.