替米沙坦抑制大鼠非酒精性脂肪肝纖維化

李 欣，金愛花，黃 媛，李成浩，金海燕

(延邊大學 附屬醫院 消化內科，吉林 延吉 133000)

研究論文

替米沙坦抑制大鼠非酒精性脂肪肝纖維化

李 欣，金愛花，黃 媛，李成浩，金海燕*

(延邊大學 附屬醫院 消化內科，吉林 延吉 133000)

目的探討替米沙坦(Tel)對大鼠非酒精性脂肪肝纖維化(NAFLF)的抑制作用。方法60只Wistar大鼠隨機均分為6個組，對照組用含膽堿的氨基酸(CSAA)飼料喂養，添加0(CSAA組)或2.5 mg/(kg BW)(CDAA治療組)的Tel；剩余4組用膽堿缺乏的氨基酸(CDAA)飼料喂養復制非酒精性脂肪肝纖維化模型，分別添加0 (CDAA組)、0.5 (低)、1.0 (中)和2.5 mg/(kg BW) (高濃度組)的Tel，共10周。常規方法檢測血清生化指標。免疫組化法觀察肝組織α-平滑肌激動蛋白(α-SMA)和轉化生長因子-β1(TGF-β1)的表達；實時定量PCR法測定肝組織Ⅰ型前膠原、金屬基質蛋白酶(MMPs)及其抑制物(TIMPs)的表達。結果CDAA組血漿中透明質酸，堿性磷酸酶，γ-谷氨酰轉肽酶和總膽紅素均高于CDAA添加Tel組(Plt;0.05 或Plt;0.01)；肝組織α-SMA 和TGFβ1定量分析表明，CDAA組表達明顯高于CDAA添加Tel組(均Plt;0.01)。CDAA組的Ⅰ型前膠原表達明顯高于CDAA添加Tel組(Plt;0.01)，且隨著Tel劑量的增加，表達逐漸減少；同時MMP- 13表達上升(Plt;0.01)，而MMP- 2及9和TIMP- 1及2的表達下降(Plt;0.01)；Tel控制CDAA喂養大鼠的體質量增加。結論替米沙坦可通過抑制肝星狀細胞的活化而阻止NAFLF的形成，有望成為控制非酒精性脂肪肝病發展的很有前景的藥物。

替米沙坦；肝纖維化；肝星狀細胞；非酒精性脂肪肝病

目前，非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)在發達國家已成為慢性肝病的主要病因，做為一種進展性與代謝相關的肝病，包括了單純性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)、非酒精性脂肪肝纖維化(non-alcoholic fatty liver fibrosis, NAFLF)、肝硬化和肝癌[1- 2]。腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system, RAS)在肝纖維化發展中起重要作用, 其中血管緊張素Ⅱ是主要作用因子[3]，它可作用于血管緊張素Ⅱ的Ⅰ型受體(angiotensinⅡ type 1 receptor, AT1)而發揮作用。眾所周知，肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)是肝纖維化形成的關鍵細胞[4]，HSC可表達AT1[5]。NASH的病理并不十分清楚，但在大多數情況下與胰島素抵抗相關[6]。替米沙坦(telmisatan, Tel)是AT1拮抗劑，可作為選擇性的過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR γ)激動劑，起到胰島素增敏作用[7]。本研究通過膽堿缺乏的氨基酸(choline-deficient L-amino acid-defined, CDAA)飼料誘導NASH模型[8]，探討Tel對NASH相關性肝纖維化形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：清潔級雄性Wistar大鼠，6周齡，體質量140 ～150 g[延邊大學醫學部實驗動物中心提供，合格證號SCXK (吉) 2011- 0007 ] 飼養溫度23 ℃±2 ℃；濕度50%±20%；12 h光照和黑夜循環，水和食物均為隨意攝取。

1.1.2 動物飼料：CDAA飼料和含膽堿的氨基酸 (choline- supplemented L-amino acid-defined, CSAA) 飼料購于南通特洛菲飼料科技有限公司。替米沙坦(江蘇萬邦制藥)，研磨成粉末后與CDAA和CSAA飼料均勻混合，最終達到每只大鼠進食Tel的量為0.5、1.0和2.5 mg/(kg BW)。

1.1.3 主要試劑：大鼠透明質酸 (hyaluronic acid, HA) ELISA試劑盒(上海凱博生物)，偶氮卡紅(Azan)染色試劑盒(American MasterTech公司)，免疫組化ABC試劑盒(Vector Laboratories公司)，α-平滑肌激動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗體(Dako公司)，轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)抗體(Santa Cruz公司)，總RNA提取試劑盒(Qiagen公司)，cDNA合成用AMV反轉錄試劑(Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物模型分組：大鼠以普通飼料喂養1周后，隨機均分為6組。兩組用CSAA飼料喂養，添加不同濃度的Tel，最終達到每只大鼠進食Tel的量分別為0(CSAA組)和2.5 mg/(kg BW) (CSAA治療組)；模型組以CDAA飼料喂養，添加不同濃度的Tel，最終達到每只大鼠進食Tel的量分別為0(CDAA組)、0.5 (低)、1.0 (中)和2.5 mg/(kg BW) (高濃度組)。實驗周期為10周，為使各組大鼠的進食量相等，在飼料完全消耗后添加新的飼料。10周末，所有大鼠禁食12 h后，水合氯醛(250 mg/Kg)麻醉下稱取體質量后，經腹主動脈采血，常規制備血清；再取出肝臟并稱取質量，留取肝右葉組織，制備病理組織和免疫組織化學標本，部分于-80 ℃凍存。

1.2.2 檢測血清纖維化及肝功能指標：按試劑盒要求用ELISA方法檢測HA；生化法檢測總膽汁酸(to-tal bile acid, TBA)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)，γ-谷氨酰轉肽酶(γ-gluamyl transpeptidase, γ-GTP)，丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和總膽紅素(total bilirubin, TBIL)。

1.2.3 免疫組化法檢測：α-SMA和TGF-β1經甲醛固定的石蠟包埋的肝臟標本，切成5 μm厚用于Azan stain和免疫組化。Azan染色按試劑盒說明操作，測定細胞外基質(extracellular matrix, ECM)沉積的表達。免疫組化按既往的抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復合物法[9]，使用Vectastain ABC試劑盒，α-SMA抗體稀釋為1∶250，TGF-β1抗體稀釋為1∶100。定量分析使用了Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統(xiamen motic software engineering Co., LTD)。

1.2.4 實時定量PCR法檢測Ⅰ型前膠原、纖維降解基因和促纖維化基因：凍存的肝組織總RNA提取和cDNA合成分別使用了相應的試劑盒，按照如前[9]的檢測方法，測定了Ⅰ型前膠原(type Ⅰ procollagen)、金屬基質蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)、金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)信使RNA(messenger RNA, mRNA)的量，引物如前所示[10]。

1.3 統計學分析

采用SPSS17.0統計軟件對實驗結果進行分析，計量資料以均數±標準差(x±s)表示，用t檢驗進行統計學分析。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量和肝臟質量

CDAA添加Tel后大鼠體質量隨著Tel濃度的增加而減少，與CDAA組比較Plt;0.05或Plt;0.01。另一方面，CDAA添加Tel后大鼠的肝臟質量均較CDAA組大鼠的減輕(表1)。

表1 各組大鼠的體質量及肝質量

*Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with CSAA group;#Plt;0.05,##Plt;0.01 compared with CDAA group.

2.2 各組大鼠的肝臟血清生化學結果

喂食CDAA同時添加不同劑量的Tel，血漿中HA含量均低于CDAA組，各組隨著Tel濃度的增加HA含量逐漸減少，且均高于CSAA組。血清TBA, ALP，γ-GTP和TBIL也顯示了相似的結果。而血清ALT水平在CDAA添加Tel后，各組均高于CDAA組，且隨著Tel濃度的增加而上升，但在CSAA組和CSAA治療組之間無差異(表2)。

2.3 各組大鼠肝纖維化程度

CDAA組顯示了明顯的纖維化，添加了不同劑量的Tel后，肝纖維化程度逐漸減輕，圖像分析結果表明，添加Tel后各組纖維陽性面積與CDAA組比較均減少(Plt;0.01)(圖1)。

2.4 肝組織α-SMA和TGFβ1的表達

Alpha-SMA在CDAA組的肝臟中明顯表達，并主要沿著纖維地帶分布。α-SMA陽性面積在添加了Tel組明顯少于CDAA組。定量分析顯示，添加Tel組的α-SMA陽性面積與CDAA組比較均減少(Plt;0.01)(圖2)。TGFβ1陽性所見主要分布于纖維隔膜區域，圖像分析表明CDAA組明顯高于Tel添加組(均Plt;0.01)(圖3)。

表2 各組大鼠血清中的HA、TBA、ALP、ALT、r-GT及Tbil水平Table 2 The lever of HA, TBA, ALP, ALT, r-GT and Tbil in serum of each group rats(±s,n=10)

*Plt;0.01 compared with CSAA group;#Plt;0.05,##Plt;0.01 compared with CDAA group.

2.5 肝組織纖維化基因的表達

CDAA組的Ⅰ型前膠原的mRNA明顯高于Tel添加組，且隨著Tel的劑量的增加，其表達逐漸減少，同時MMP- 13的表達上升；添加Tel后，肝組織表達MMP- 2和9以及它們的抑制物TIMP- 1和2均同時下降(圖4)。上述各項指標在CSAA組和CSAA治療組之間無任何差異，且均與CDAA組和Tel添加組之間存在顯著差異，故數據未逐一列出。

3 討論

NASH的發病機理尚不十分清楚，喂食CDAA飼料的大鼠，能發展為脂肪肝、 肝硬化和肝細胞癌，大鼠喂食CDAA飼料后1周可發展為脂肪肝，第4周開始出現肝纖維化，此后分別從第12周和第30周進展為肝硬化或肝細胞癌[11]。本研究的主要目的是觀察Tel對CDAA飼料誘導的肝纖維化形成的影響，因此設計了喂食CDAA飼料10周，這一肝纖維化基本形成階段進行研究。文獻報道表明，PPAR γ在調節碳水化合物和脂質代謝中起重要作用，PPAR γ的配體能提高胰島素敏感性[12]，它的全配體，常常伴隨液體潴留、體質量增加和浮腫[7]。而Tel不同，它是作為PPAR γ的部分配體。從本研究中可以看出，Tel的用量與臨床上口服量相一致時，即可作為PPAR γ的一種選擇性調節劑，還可作為AT1的拮抗劑，在進食量絕對相等的情況下，Tel控制了CDAA引起的大鼠體質量的增加，這一結果與其他研究報道一致[13]。同樣，由于Tel可控制CDAA引起的肝臟中脂肪的沉積，故添加Tel后肝臟質量比CDAA組的輕。因此，Tel比起其他的血管緊張素受體的拮抗劑更適合治療NASH相關的肝纖維化。

A.CDAA; B.CDAA+Tel+low; C.CDAA+Tel+med;D.CDAA+Tel-high;*Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with CDAA group

圖1Azan染色檢測大鼠肝臟纖維化程度
Fig1ExtentofECMwasdetectedbyAzanstain(×40)

A.CDAA; B.CDAA+Tel+low; C.CDAA+Tel+med;D.CDAA+Tel-high; *Plt;0.01 compared with CDAA group

A.CDAA; B.CDAA+Tel+low; C.CDAA+Tel+med;D.CDAA+Tel-high; *Plt;0.01 compared with CDAA group

*Plt;0.01 compared with CDAA group圖4 Real-time PCR檢測肝組織中纖維化形成基因和纖維化降解基因的mRNA水平Fig 4 The mRNA expression level of fibrogensis and fibrolysis genes in each group was detected by real-time PCR

血清HA、TBA和ALP水平與肝纖維化程度相平行, 本研究結果說明，添加Tel組的肝纖維化程度降低了。CDAA添加Tel后血清ALT水平高于CDAA組，說明添加Tel組的大鼠肝組織中尚存較多的肝細胞，而CDAA組的大鼠已經發展成了嚴重的肝纖維化，殘留的肝細胞數量明顯減少。CSAA組與CSAA治療組之間ALT水平無差異，證明Tel對大鼠肝細胞無損傷作用。

添加Tel的大鼠肝臟組織表達ECM的量明顯少于CDAA組，進一步證實了Tel可抑制CDAA誘導的大鼠肝纖維化的形成。HSC通過活化在肝纖維化形成中起重要作用[4]，α-SMA是HSC活化的金標準，添加Tel后大鼠肝組織對其表達明顯減少，說明了Tel可通過抑制HSC的活化控制肝纖維化形成。TGF β1在RAS相關的肝纖維化發展中起重要作用，Ⅰ型膠原是肝纖維化時ECM的最主要成分，而TGF β1是促進HSC活化而產生膠原的最強因子。添加Tel后大鼠肝組織表達Ⅰ型膠原和TGF β1的量明顯下降。已知肝纖維化可被MMPs降解，而MMPs的活性又可被它們的抑制物TIMPs所抵抗[14]。本研究中，添加Tel后肝臟表達MMP- 13 增加，MMP- 13是降解ECM的主要因子；另一方面，添加Tel后肝臟表達MMP- 2,9 和TIMP- 1,2的量比CDAA組減少，說明它們的表達與肝纖維化的程度相平行，這與其他文獻報道一致[15]。

NAFLD是一種代謝綜合征，Tel主要用于控制血壓，它同時能控制患者的體質量，并且對NAFLD相關的肝纖維化的發生有預防作用，是一種有前景的治療NAFLD藥物。

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Inhibitory effect of telmisartan on non-alcoholic fatty liver fibrosis in rats

LI Xin, JIN Ai-hua, HUANG Yuan, LI Cheng-hao, JIN Hai-yan*

(Dept. of Gastroenterology and Hepatology, the Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, China)

ObjectiveTo study the inhibited effect of telmisartan (Tel) on non-alcoholic fatty liver fibrosis (NLFLF) in rats.MethodsSixty Wistar rats were randomly and equally divided into 6 groups. Two groups of them supplied with choline-supplemented L-amino acid-defined diet(CSAA): CSAA group fed with CSAA diet only, CSAA treatment group fed with CSAA diet and supplemented with Tel of 2.5 mg/(kg BW·d)(CSAA+Tel-high). The residual four groups fed with choline-deficient L-amino acid-defined (CDAA) diet and supplemented with Tel of 0(CDAA), 0.5 (CDAA+Tel-low), 1.0(CDAA+Tel-med) and 2.5(CDAA+Tel-high) mg/(kg BW·d). The total experimental period was 10 weeks. Serum biological parameters were routinely determined. Expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in liver tissue were determined by immunohistochemistry, and pathological changes in liver tissues were detected by Azan staining. The

messenger RNA (mRNA) expressions of type I procollagen, matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMPs) were evaluated using real-time quantitative PCR.ResultsThe levels of hyaluronic acid, alkaline phosphatase, γ-gluamyl transpeptidase and total bilirubin in serum of CDAA group were all higher than those of CDAA diet supplemented with Tel (Plt;0.05 orPlt;0.01). The quantity of α-SMA and TGF-β1 was higher in CDAA rats compared with Tel treated rats(Plt;0.01). The mRNA of type I procollagen was higher than that of the Tel treated rats(Plt;0.01), and that decreasing as the dose of Tel increasing; on the same time, the expression of MMP13 increased, while the expression of MMP2,9 and TIMP1,2 decreased. Tel also controlled the body weight gain of CDAA diet rats.ConclusionsTel suppresses NLFLF in rats through inhibiting HSCs activation, it may become a promising medicine to control non-alcoholic fatty liver disease.

telmisartan; liver fibrosis; hepatic stellate cell; non-alcoholic fatty liver disease

2014- 02- 07

2014- 04- 21

國家自然科學基金(81160059)；吉林省科技廳項目(200905210)；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目(201208)

*通信作者(correspondingauthor)：jinhyyj@msn.com

1001-6325(2014)10-1321-06

R 575

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