NOK癌基因對人胚腎293T細胞周期G1/S期的影響及其作用機制

劉 斌，劉 力

(中國醫學科學院 基礎醫學研究所 北京協和醫學院 基礎學院 病原生物學系，北京 100005)

NOK癌基因對人胚腎293T細胞周期G1/S期的影響及其作用機制

劉 斌，劉 力*

(中國醫學科學院 基礎醫學研究所 北京協和醫學院 基礎學院 病原生物學系，北京 100005)

目的探討NOK癌基因對人胚腎293T細胞周期G1/S期的影響，并研究NOK對G1/S期調控的作用機制。方法用流式細胞儀對瞬時轉染NOK及pcDNA3.0空載體的293T、293ET及HeLa細胞進行周期檢測，并用免疫印跡法(Western blot)在293T細胞中，對其細胞周期G1/S期檢驗點調控蛋白cyclin D/E1及CDK2/4等蛋白水平進行檢測。結果瞬時轉染NOK可使293T、293ET及HeLa細胞G1期較轉染空載體pcDNA3.0的細胞比例減少，S期比例增多 (Plt;0.05)。轉染NOK可使G1/S期檢驗點相關蛋白cyclin D、cyclin E1、p-CDK-2、p-CDK-4、p-Akt及p-Rb蛋白的表達量上升，使P21及P53蛋白表達量下降。結論NOK可促進細胞快速通過細胞G1/S期檢測點，其機制涉及對Akt及CDK2/4通路的影響。

NOK；細胞周期；周期素

細胞周期是細胞重要的生理過程，而細胞周期異常與腫瘤發生密切相關。惡性腫瘤的特征之一在于細胞周期穩態的失控，所以，對于細胞周期的研究對了解腫瘤細胞的增殖與分化有重要作用[1]。NOK(novel oncogene with kinase-domain)是從人扁桃體癌中克隆出的一個新型癌基因，之前的研究已經證明，NOK具有腫瘤基因的特征，其可以促進BaF3細胞向腫瘤轉化，誘導腫瘤細胞向遠端器官侵襲和轉移，且這種致癌效果可在多種組織臟器中發揮作用[2]，在乳腺癌和肺癌等惡性腫瘤中均有體現[3]。然而，對于NOK在調控細胞周期中的作用機制尚未見報道。本研究就NOK對于細胞周期的影響進行了一些初步的研究，以期為進一步揭示NOK的致癌性作用機制以及為抗NOK藥物篩選提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及轉染

將293T，293ET及HeLa細胞置于10%胎牛血清的DMEM中培養，放入37 ℃、5%CO2細胞培養箱，待其貼壁增殖至80%～90%匯合時，更換培養液。換液后1 h，使用高效真核轉染試劑對細胞進行瞬時轉染，分別轉入pcDNA3.0(5、4及0 μg)和pcDNA-NOK-HA(或簡稱NOK-HA) (5、1及0 μg)。轉染后2 h更換培養基，48 h收獲細胞。

1.2 流式細胞檢測細胞周期

取大約3×106個收獲的細胞置于1.5 mL離心管，5 000r/min離心5 min，棄去上清后用4 ℃ PBS洗滌兩遍，棄去上清。加入0.3 mL 4 ℃ PBS重懸沉淀，后用4 ℃無水乙醇逐滴加入，并輕輕振動，使之成為單細胞懸液。將離心管置于-20 ℃冰箱內進行沉淀，24 h后取出離心管，5 000r/min離心5 min去乙醇，使用4 ℃ PBS洗滌兩遍，并重懸，加入1 μL RNase A，放入37 ℃孵箱水浴0.5 h，通過冰浴終止反應。加入100 μL PI染色液避光染色10 min后，使用COULTER 流式細胞儀進行細胞周期檢測。本研究中，所有流式檢測設平行試驗3組，探討NOK對細胞周期的影響。

1.3 Western bolt檢測蛋白表達水平

取收獲細胞于1.5 mL離心管中，12 000r/min離心8 min，棄去上清后用4 ℃ PBS洗滌兩遍，棄去上清。加入0.2 mL細胞裂解液重懸，冰浴20 min裂解細胞，后12 000r/min離心10 min，取上清進行Western blot檢測。使用Quantity One進行吸光度比值測定。

1.4 實驗材料

實驗所用細胞(中國醫學科學院基礎所細胞中心提供)，轉染試劑(Vigorous公司)，RNase A(Sigma公司)，細胞裂解液(北京賽馳生物科技有限公司)，抗體(Bioworld公司)。

1.5 統計方法

2 結果

2.1NOK促進293T、293ET及HeLa細胞由G1期進入S期

轉染pcDNA3.0的293T細胞(圖1A)G1期所占比例為(49.10±1.23)%，S期所占比例為(50.75±1.08)%，而轉染了NOK-HA的293T細胞(圖1B)G1期所占比例為(41.51±0.12)%，S期所占比例為(58.49±0.12)%，A組細胞G1期比例大于B組，S期比例小于B組 (Plt;0.05)。同時，在293ET(圖2)及HeLa(圖3)細胞中也分別進行了同樣的實驗。與轉染293T細胞結果一致，在293ET和HeL細胞中轉染了pcDNA3.0的A組細胞G1期比例大于轉染了NOK-HA的B組細胞，而S期比例則小于B組細胞 (Plt;0.05)。

2.2 NOK對cyclin-CDKs蛋白的影響

293T細胞中，隨著NOK轉染量的上升，細胞周期素D1及與之復合的p-CDK4蛋白表達量上升(圖4A)，細胞cyclin E及與之復合的p-CDK2蛋白表達量亦上升(圖4B)。

2.3 NOK對細胞Akt通路的影響

過表達NOK可以促進CDK上游增殖信號Akt通路的活化，促進p-Akt蛋白水平量的上升，且顯著抑制CDK抑制因子P21蛋白的表達，以及抑制抑癌基因P53的表達(圖5A)。此外，過表達NOK可顯著提高CDK下游基因Rb蛋白的磷酸化水平(圖5B)。

A.FCM result of 5 mg pcDNA 3.0 transient transfection in a 35 mm dish; B.FCM result of 5 mg NOK-HA transient transfection in a 35mm dish; C.statistics result of the G1/S distribution of 293T cell;*Plt;0.01 compared with pcDNA 3.0

A.FCM result of 5 mg pcDNA 3.0 transient transfection in a 35 mm dish; B.FCM result of 5 mg NOK-HA transient transfection in a 35 mm dish; C.statistics result of the G1/S distribution of 293ET cell;*Plt;0.05 compared with pcDNA 3.0

A.FCM result of 5 mg pcDNA 3.0 transient transfection in a 35 mm dish; B.FCM result of 5 mg NOK-HA transient transfection in a 35 mm dish; C.statistics result of the G1/S distribution of HeLa cell;*Plt;0.01 compared with pcDNA3.0

圖4 NOK對細胞Cyclin-CDKs蛋白的變化水平Fig 4 The protein levels change of cyclin-CDKs in responding to increased doses of NOK

A.alterations of upstream proteins of CDKs in responding toNOKover-expression; B.changes of downstream protein of CDKs in responding toNOKover-expression

圖5NOK對CDK上游及下游相關調控基因的影響
Fig5TheeffectsofNOKontheexpressionsofupstreamordownstreamregulatorygenesofCDKs

3 討論

NOK是一個受體型蛋白酪氨酸激酶分子(RPTKs)，而RPTKs在細胞的不同階段都發揮著重要作用[4]，之前的研究已經證明了NOK具有與FGFR/EGFR的高度同源性，且已經證明其具有一定的致癌性。但由于NOK缺少胞外配體結合區域，所以對于胞外信號受NOK調控的機制尚不清晰[5]。過度增殖是腫瘤細胞的特征之一，而細胞周期的改變是造成細胞增殖的重要原因。在本研究中，過表達NOK基因，可以使細胞停留在G1期的百分比下降，停留在S期的百分比上升，這提示NOK基因可能具有使細胞快速從G1期向S期轉化的作用，進而使細胞周期縮短，提高細胞增殖率。

在正常細胞中，細胞周期的各個時點存在著起到關鍵作用的調控點，發揮著“開關”式的作用。這其中細胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)因子起到了核心作用，CDK因子主要是依賴于細胞周期素(cyclins)發揮特異性調控作用[6]。具體到細胞G1/S期調控，已有大量研究證明，cyclin D1-CDK4和cyclin E-CDK2是構成細胞G1/S期檢測點的重要部分，其共同激活Rb蛋白，使其磷酸化，調節細胞進入S期[7]。本研究中，293T、293ET及HeLa細胞流式結果趨勢基本一致，故本研究只選用了293T細胞作為蛋白水平檢測細胞系。在本研究中，在293T細胞中，過表達NOK可以使cyclinD1及cyclinE表達量上升，且可促進CDK2和CDK4的磷酸化，提示NOK可能促進細胞cyclin D1-CDK4和cyclin E-CDK2復合物的形成，同時，過表達NOK使磷酸化Rb蛋白表達量上升(圖5B)，也提示了NOK可能通過調節G1/S期檢測點關鍵蛋白的方式，促進細胞由G1期向S期轉變。上述結果證明并解釋了流式細胞周期檢測結果。

Akt蛋白的活性與細胞周期有密切關系[8-9]，在本研究中，探討NOK對于細胞G1/S檢測點關鍵蛋白發揮作用的機制，對于其相關的信號通路進行了檢測。研究結果顯示，過表達NOK可以促進磷酸化Akt蛋白(p-Akt)的表達，進而起到激活Akt信號通路的作用，同時，處于Akt信號通路下游的P21及P53因子表達水平有所降低(圖5A)，而P21與P53分子已被證明可以作用于細胞G1/S期檢測點，其表達量上升有抑制CDK蛋白磷酸化的作用，使細胞停留在G1期[10]。由此本研究認為，NOK可能通過影響Akt信號通路的活性，降低P21及P53因子的表達水平，進而提高CDK因子的磷酸化水平，促進cyclins-CDKs復合物的形成，致使Rb蛋白磷酸化，釋放轉錄因子E2F，激活E2F/DP，促進DNA聚合酶等的轉錄過程，使細胞更快速的通過G1/S期檢測點，由G1期進入S期，從而縮短了細胞周期。

盡管本研究已對NOK對于細胞周期的影響及其可能涉及到的信號通路做了初步研究，但NO對于細胞周期發揮作用的完整機制尚不清晰，且對于NOK基因在何位置介入到細胞周期調控網絡中也不明確，相關工作將在后續研究中予以證明。

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Influence and mechanism ofNOKoncogene on G1/S distribution in human embryonic kidney 293T cells

LIU Bin, LIU Li*

(Dept. of Microbiology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, School of Basic Medicine, PUMC, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo analyze the influence of theNOKoncogene on the G1/S distribution in 293T cells and to elucidate the regulated mechanisms responsible forNOKmediated G1/S phase control.MethodsAfter transiently transfectingNOKinto 293T, 293ET and HeLa cells, we detected the cell cycle distribution by flow cytometry. Then, we detected the protein expressions of G1/S check point related genes such as cyclin D, cyclin E1,CDK2 and CDK4 by western blot analysis.ResultsIn the 293T,293ET and HeLa cell which was transfected byNOK, the G1phase proportions of cells were reduced, but the S phase proportion of cells was increased (Plt;0.05). Significant up-regulations in the expressions of cyclin D,cyclin E1, p-CDK-2, p-CDK-4, p-Akt and p-Rb were observed with the increased delivery ofNOKinto 293ET cells.ConclusionsNOKcan promote cell cycle progression by rapidly passing the G1/S check point, which may involve the activation of both Akt and CDK2/4 signaling pathways.

NOK; cell cycle; cyclin

2013-12-23

2014-01-07

國家自然科學基金(30871283,81171944)

*通信作者(correspondingauthor)： lliu@pumc.edu.cn

1001-6325(2014)04-0470-05

研究論文

R 113

A