不同凍存液保存的顆粒性脂肪組織活力及移植成活率分析

仇侃敏，吳 蒙，梁耀蟬，羅婕姝，謝紅炬*

(1.南華大學 第一附屬醫院 醫療美容科，湖南 長沙 421001； 2.北京英煌醫療美容整形門診， 北京 100031)

不同凍存液保存的顆粒性脂肪組織活力及移植成活率分析

仇侃敏1，吳 蒙1，梁耀蟬2，羅婕姝1，謝紅炬1*

(1.南華大學 第一附屬醫院 醫療美容科，湖南 長沙 421001； 2.北京英煌醫療美容整形門診， 北京 100031)

目的研究以基礎培養液DMEM高糖和胎牛血清作為凍存基礎液是否有助于提高脂肪組織復溫后的存活率及移植后的成活率。方法分別用1×高糖DMEM培養基和純胎牛血清作為配制滲透性玻璃化冷凍保護劑的基礎液，將脂肪組織放置-180 ℃液氮中凍存，于凍存2個月后取出脂肪組織，復溫后通過肌酸激酶法、錐蟲藍染色、MTT細胞增殖實驗和異種移植等方法，比較脂肪細胞的存活率、酶活性及增殖能力，并于體內移植4個月后取出移植物，比較移植物的體積、吸收率、脂肪組織結構等情況。結果胎牛血清凍存組脂肪組織復溫后的存活率、細胞活性、存活能力及移植后的成活率明顯高于對照組(Plt;0.01)。結論胎牛血清作為凍存基礎液能夠明顯提高凍存脂肪組織復溫后的存活率、細胞活性、存活能力及移植后的成活率。

脂肪組織；凍存；存活率；移植成活率

脂肪除了因含有豐富的間充質干細胞而備受關注外[1-2]，它還是一種理想的組織缺損填充材料[3]，可用于全身各部位的組織缺損填充。為了提高成活率、減少吸收率，國內外學者進行了大量研究，包括改進移植方法、細胞因子干預、轉基因等[4-7]，一定程度上提高了脂肪移植的成活率，但目前移植成活率仍在50%左右。臨床上要通過少量、多次移植提高移植成活率，獲得滿意的填充效果。這對患者造成多次抽脂的痛苦、較高的風險及費用。如果能把多余脂肪貯存起來，按照預定計劃進行移植，避免多次手術，提高成活率，有望獲得良好的治療效果。

目前已有數篇冷凍脂肪注射移植成活的報道[8-10]。但關于優化脂肪凍存條件的研究較少，15%二甲基亞砜有利于脂肪組織活力的保持[11]，但細胞毒性作用限制了其應用。本實驗擬研究高糖DMEM和胎牛血清對凍存脂肪組織的活力和移植成活率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腹部脂肪顆粒：來源于南華大學第一附屬醫院醫療美容科，供者年齡35～55歲。經南華大學倫理委員會批準免除知情同意。

1.1.2 實驗動物：SPF級SD大鼠，雌雄不限，體質量180±25 g(長沙天勤生物技術有限公司，合格證號SCXK(湘)2009-0012)，隨機分組，每組10只。

1.1.3 試劑：二甲基亞砜(DMSO，北京益利化學品有限公司)、肌酸激酶活性測定試劑盒(北京中生北控生物公司)、高糖DMEM(H-DMEM，Gibco公司)、國產胎牛血清(天津血液研究所)、鼠抗人CD34單克隆抗體和免疫組化試劑盒(Santa公司)、MTT(Sigma公司)和錐蟲藍染色液(上海碧云天生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 脂肪顆粒分組凍存：低溫保護劑分為0.9% NaCl注射液+體積分數8% DMSO組(0.9% NaCl+8% DMSO)、H-DMEM+體積分數8% DMSO組(H-DMEM+8% DMSO)和胎牛血清(FBS)+體積分數8% DMSO組(FBS+8% DMSO)。凍存時脂肪與凍存液按體積比1∶1混合。

1.2.2 錐蟲藍染色：按參考文獻[11]進行操作。×200高倍鏡下計數；細胞存活率=(總細胞數-死細胞數)/總細胞數×100%。

1.2.3 MTT細胞增殖實驗：接種細胞：對數增殖期細胞以1 000個/孔接種于96孔培養板，每孔體積200 μL，放37 ℃，5% CO2培養箱中培養，分別于培養的第1、2、3、4和5天取樣檢測。MTT顯色：按照試劑盒說明書操作。比色：570 nm波長下測定各孔吸光度值，每組設3個復孔。以時間為橫軸，吸光度值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.2.4 肌酸激酶活力測定實驗：按照試劑盒說明書操作。分別于2 min及3 min時吸取1 mL混合液在波長為340 nm處測定A值(A1及A2)。各組酶活力用△A值表示(△A=A2-A1)。

1.2.5 脂肪組織異種移植實驗：將脂肪組織或脂肪組織與細胞的混合物按照1.0 mL/只，移植入大鼠背部皮下。12周后分析移植物質量和體積，組織切片HE染色，免疫組化分析微血管密度，計算移植吸收率：(移植起始體積-實驗終點體積)/移植起始體積×100%。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 錐蟲藍染色分析細胞存活率

凍存8周后復溫，0.9% NaCl+8% DMSO凍存組細胞存活率與H-DMEM+8% DMSO凍存組無差異；FBS+8% DMSO凍存組細胞存活率明顯高于0.9% NaCl +8% DMSO凍存的對照組(Plt;0.001)(圖1)。

2.2 細胞活力比較

脂肪組織凍存8周后復溫，H-DMEM+8% DMSO凍存組細胞各時間點肌酸激酶活力與0.9% NaCl +8% DMSO凍存的對照組無明顯差異(圖2)；FBS+8% DMSO凍存組細胞的肌酸激酶活力明顯高于0.9% NaCl+8% DMSO凍存的對照組(Plt;0.01)(圖2)。

2.3 MTT實驗測定細胞在體外的存活能力

顆粒脂肪組織凍存12周后復溫， H-DMEM+8% DMSO凍存組細胞各時間點存活率與0.9% NaCl+8% DMSO凍存的對照組相比差異不顯著(圖3)；FBS+8% DMSO凍存組細胞3～7 d的存活率明顯高于0.9% NaCl+8% DMSO凍存的對照組(Plt;0.05)(圖3)。

A.results were observed in the light microscope; B.cell survival rate was calculated by cell counter; high glucose DMEM.H-DMEM; fetal bovine serum.FBS; the arrows indicate the dead cells;*Plt;0.001 compared with 0.9% NaCl+DMSO group

圖1錐蟲藍染色分析細胞的存活率

Fig1Trypanbluestainingdetectedthecellsurvivalrateoffrozenadiposetissue(×100)

High glucose DMEM.H-DMEM; fetal bovine serum.FBS; *Plt;0.01 compared with 0.9% NaCl+DMSO group圖2 肌酸激酶活性實驗分析細胞活力Fig 2 The cell viability of frozen adipose was analyzed by creatine kinase activity

High glucose DMEM.H-DMEM; fetal bovine serum; FBS; *Plt;0.05, #Plt;0.01 compared with 0.9% NaCl+DMSO group圖3 MTT實驗測定細胞的存活能力Fig 3 MTT detected the survival rate of adipocytes in frozen adipose tissue

2.4 移植成活率比較

移植12周后，0.9% NaCl+8% DMSO凍存組與H-DMEM+8% DMSO凍存組移植成活率無差異；FBS+8% DMSO凍存組移植成活率明顯高于0.9% NaCl +8% DMSO凍存組(Plt;0.001)(表1)。

2.5 移植物結構比較

HE染色顯示，0.9% NaCl+8% DMSO和H-DMEM+8% DMSO凍存的脂肪組織復溫移植后形成的包囊較厚，血管分布不均，邊緣區較多，中央較少，鏡下可見囊樣脂池和壞死區(圖4)。FBS+8% DMSO凍存組復溫移植后脂肪組織結構均勻，罕見有大的囊樣脂池形成，邊緣區包囊較薄，空泡和包囊數明顯少于0.9% NaCl +8% DMSO凍存脂肪組織移植的對照組，微血管密度(microvessel density，MVD)明顯高于對照組。而H-DMEM+8% DMSO組與對照組在包囊數與微血管密度上與對照組無明顯差異(表2)。

表1 比較移植物體積Table 1 Comparison the volume of retained fat grafts after 12-week in vivo administration

*Plt;0.001 compared with another two group.

Arrows indicated the cystic and necrotic lipid pool圖4 HE染色顯示移植物脂肪組織結構Fig 4 HE staining showed the structure of adipose tissue graft (bar=200 μm)

表2 移植物微血管密度和包囊數比較Table 2 Comparison the MVD and the cyst number ofretained fat grafts (±s, n=6)

*Plt;0.05,**Plt;0.001 compared with another two group.

3 討論

脂肪移植提供了一種簡單、微創的軟組織填充方法。脂肪移植成活后可提供永久性修正缺損部位的可能性。一般獲得脂肪組織后需立即移植以盡量減少細胞活力的下降。但目前脂肪移植仍存在50%的吸收率，臨床上要通過少量、多次移植來提高成活率，達到滿意的填充效果。顯著增加了患者的痛苦和醫療費用。因此如能實現脂肪組織長期冷凍保存具有重要的臨床價值。

冷凍條件不同，移植后的效果差異顯著。15% DMSO被發現有利于脂肪組織活力的保持[11]，但其具有細胞毒性作用。本研究發現，胎牛血清作為凍存基礎液有利于脂肪細胞活力的保持，并能夠明顯提高移植后的成活率和正常脂肪組織結構的維持。本研究進一步優化了脂肪組織的冷凍保存條件，使脂肪組織長期儲存、推遲和重復移植成為可能。

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The viability and the transplanted survival rate analysis of fat granule in cryopreservation with different frozen conditions

QIU Kan-min1, WU Meng1, LIANG Yao-chan2, LUO Jie-shu1, XIE Hong-ju1*

(1.Dept. of Medical Cosmetology, the First Affiliated Hospital, Nanhua University, Changsha 421001; 2.Beijing Yinghuang Medical Cosmetic Plastic Surgery Clinic, Beijing 100031, China)

ObjectiveTo investigate whether the high glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium and fetal bovine serum as base fluid are benefit for improve the viability and post-transplant survival rate of frozen adipose tissue.MethodsFat granules was cryopreserved at -180 ℃ in physiological saline, high glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium and fetal bovine serum respectively, adding with 8%DMSO. Rewarming at 4 weeks, the viability and post transplantation survival rate of frozen fat were determined by trypan blue staining, creatine kinase activity assay, MTT assay and xenotransplantation experiments.ResultsFrozen adipose tissue in fetal bovine serum containing 8% DMSO showed an increase in cell viability and improvement in post transplantation survival rate(Plt;0.01).ConclusionsFBS as anessential fluid can significantly improve the cell vitality and post transplantation survival rate of cryopreservation adipose tissue.

adipose tissue; cryopreservation; viability; post-transplant survival rate

2013-12-12

2014-01-07

*通信作者(correspondingauthor)： xhj1251@sina.com

1001-6325(2014)04-0536-05

研究論文

R 622

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