RNA干擾Glut1表達對MCF-7細胞增殖的影響

張秀梅，張 霞，肖建英

(遼寧醫學院 生物化學教研室， 遼寧 錦州 121000)

RNA干擾Glut1表達對MCF-7細胞增殖的影響

張秀梅，張 霞，肖建英*

(遼寧醫學院 生物化學教研室， 遼寧 錦州 121000)

葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter proteinl，Glut1)是哺乳動物轉運葡萄糖跨過細胞膜進入細胞最重要的載體[1]。許多研究證實不同來源的惡性腫瘤Glut1表達水平升高。目前研究表明：Glut1可能與惡性腫瘤的發生發展有關。本研究探討RNA干擾Glut1表達對MCF-7細胞生長增殖的抑制作用，探索腫瘤基因治療的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料:Glut1-siRNA序列：5′-UGAUGUCCAGAAGAAUA GU-3′； control-siRNA序列：5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′，人乳腺癌MCF-7細胞，Glut1兔抗人多克隆抗體。

1.2 實驗分組:實驗分為normal組，negative組，Glut1 siRNA 組。采用脂質體轉染法轉染RNA。

1.3 RT-PCR檢測Glut1 mRNA表達水平:PCR引物序列如下：Glut1上游引物：5′-CAGTTCGGCTATAACACCGGTGTC-3′，下游引物：5′-GCCAAAGGGATTAACAAAGAGGCC-3′ β-actin上游引物：5′-CCTAGCACCATGAAGATCAA-3′，下游引物：5′-TTTCTGCGCAAGTTAGGTTT-3′。轉染48 h后，采用Trizol法提取細胞總RNA，使用AMV反轉錄酶合成cDNA,進行RT-PCR。

1.5 MTT法檢測細胞增殖:將細胞接種于96孔培養板中，分別于細胞貼壁后第24、48、72和96 h加入MTT 50 μL(1 g/L)，孵育4 h，加入DMSO，振蕩15 min，使沉淀物充分溶解。用自動酶標分析儀于490 nm波長下檢測吸光度值。根據吸光度值的大小來判斷活細胞數，計算存活率。公式如下：

存活率=加藥組A值/對照組A值×100%

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期:將MCF-7細胞轉染后48 h消化成單細胞懸液，75%的乙醇4 ℃固定過夜，加入DNAStain染色液,室溫避光15 min，上機測試。

2 結果

2.1 RNA干擾后Glut1 mRNA及蛋白表達水平:與對照組比較， Glut1干擾組Glut1的mRNA及蛋白水平顯著下降(Plt;0.01)(表1，圖1)。

表1 Glut1 mRNA及蛋白表達水平Table 1 Glut1 mRNA and protein expression

*Plt;0.01 compared with normal.

1.normal; 2.negative; 3.Glut1 siRNA圖1 Glut1蛋白表達水平Fig 1 Glut1 protein expression

2.2 細胞增殖水平分析:結果顯示，細胞貼壁后72和96 h，Glut1干擾組的細胞存活率明顯少于對照組和陰性對照組(Plt;0.01，表2)。

表2 Glut1干擾后對MCF-7細胞存活率的影響Table 2 Effect of Glut1 on survival rate in MCF-7(±s，n=3)

*Plt;0.01 compared with normal.

2.3 細胞周期檢測結果:結果顯示Glut1干擾組處于G0/G1期的細胞的比例明顯高于對照組和陰性對照組，Glut1干擾組處于S期的細胞比例明顯低于對照組和陰性對照組(Plt;0.01)(圖2)。

3 討論

大量研究表明[2]，腫瘤細胞表面往往異常高表達GlutI，以增加葡萄糖的攝取滿足其能量需求，因此認為Glut1是細胞惡變的早期標志。進一步研究發現，Glut1與腫瘤細胞增殖相關，Glut1的表達水平升高可以增加腫瘤細胞對葡萄糖的攝取，滿足腫瘤細胞對能量的要求[3]。本研究利用RNA干擾技術，Glut1干擾組Glut1的mRNA及蛋白水平顯著下降，干擾效率大于50%。

MTT實驗結果顯示Glut1干擾組的細胞存活率明顯少于對照組和陰性對照組。這可能與RNA干擾后Glut1的mRNA及蛋白水平顯著降低，減少細胞對葡萄糖攝取，降低細胞能量供給，抑制細胞增殖有關。

細胞周期實驗結果顯示，Glut1干擾組處于S期的細胞比例明顯低于對照組和陰性對照組， 可能由于Glut1表達被抑制減少了細胞對葡萄糖的攝取，繼而使得細胞能量供給減少，細胞停留在能量需要較少的細胞周期階段，或離開細胞周期，即停止增殖。

綜上所述，Glut1干擾對MCF-7細胞的生長增殖有顯著影響，這為深入理解Glut1在腫瘤發生發展中所起作用及具體機制提供新的思路，也為Glut1干擾治療腫瘤提供理論依據。

[1] Ayala FR, Rocha RM, Carvalho KC,etal.Glut1 and Glut3 as potential prognostic markers for oral squamous cell carcinoma [J].Molecules, 2010,15: 2374-2387.

[2] Frolova A, Flessner L, Chi M,etal. Facilitative glucose transporter type 1 is differentially regulated by progesterone and estrogen in murine and human endometrial stromal cells[J].Endocrinology, 2009,150: 1512-1520.

[3] Kalir T, Wang BY, Goldfischer M,etal. Immunohistochemical staining of GLUT1 in benign, borderline and malignant ovarian epithelia.[J].Cancer,2002,94:1078-1082.

2013-05-30

2013-09-26

遼寧省教育廳重點實驗室項目(LS2010101)

*通信作者(correspondingauthor)： xiaojianying6886@yahoo.com.cn

1001-6325(2014)04-0546-02

R 736.1

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