人乳頭瘤病毒的環介導等溫擴增檢測法

羅永富

(湖南中醫藥高等專科學校 基礎醫學部， 湖南 株洲 412012)

人乳頭瘤病毒的環介導等溫擴增檢測法

羅永富*

(湖南中醫藥高等專科學校 基礎醫學部， 湖南 株洲 412012)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是引起尖銳濕疣甚至癌變的病原體。PCR技術檢測病毒DNA序列具有特異、敏感等特點，但對儀器設備及檢測人員技術要求較高，不適合于基層醫療單位臨床實驗室的常規診斷方法。環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術針對靶基因6個區域設計4條特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在恒溫條件下完成擴增，擴增效果可用凝膠電泳、比濁、染色等多種方法檢測，具有反應時間短、肉眼可判斷結果和不需要PCR儀等優點。國內外利用LAMP技術檢測HPV的方法研究偶有報道[1-2]，但針對HPV-6和HPV-11成功的方法研究未見文獻報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本來源：10例標本均取自邵陽醫專附屬醫院基因診斷室。在告知患者并征得同意的情況下由門診醫生用棉拭子在患者外陰部疑似病灶部位涂抹，置于裝有1 mL無菌0.9%氯化鈉注射液的試管中送檢。其中6例經熒光PCR驗證為HPV病毒陽性臨床標本；2例沙眼衣原體陽性標本和2例解脲支原體陽性標本作為LAMP檢測HPV病毒的陰性對照。

1.1.2 試劑：限制性內切酶(Promega公司)；Betaine(Fluka公司)；Bst DNA Polymerase(Biolabs 公司)；100 bp DNA Ladder(BioDev公司)；DNA Maker Ⅰ(天根公司)；dNTP 和Taq plus DNA聚合酶(北京鼎國公司)；病毒DNA提取試劑盒(四川天澤公司)；MgSO4(Sigma公司)；SYBR Green Ⅰ(北京天恩澤基因科技有限公司)；其余試劑為國產分析純。

1.1.3 引物：選取HPV-6E6基因(基因序號：AF092932)的174～381 bp序列和HPV-11E6基因(基因序號：M14119)的129～306 bp區域序列，用專用引物軟件(Primer Explorer V4)分別設計HPV-6與HPV-11正向外引物(F3)、反向外引物(B3)、正向內引物(FIP)和反向內引物(BIP)4條，引物由廣州英駿公司合成。用BLAST軟件進行互補分析，HPV-6的4條引物不與HPV-11E6 DNA序列互補；HPV-11的4條引物不與HPV-6E6 DNA序列互補。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理與DNA提取液的制備:將10例送檢標本充分振蕩懸浮，擠干棉拭子中的水分，棄棉拭子，15 000 r/ min離心5 min，棄上清液，留沉淀，加600 μL病毒DNA提取液充分混勻，加700 μL異丙醇，振蕩混勻，12 000 r/ min離心1 min，棄上清液，沉淀用75%乙醇洗滌2次，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，將離心管倒置于濾紙上10～15 min，待酒精揮發干凈后加入100 μL TE溶液4 ℃過夜充分溶解DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.2 環介導等溫擴增(LAMP):取兩組反應杯，每組10只，標以①～⑩的標號，其中①～⑥為PCR確定的臨床HPV陽性標本，⑦～⑩為4例陰性對照標本。每只反應杯對應加入DNA提取液2.0 μL，第一組加入HPV-6的4條引物，第二組加入HPV-11的4條引物，加入其他試劑。置于65 ℃孵育60 min。然后置于80 ℃ 2 min滅活酶，終止擴增。

1.2.3 電泳與結果判斷:取1 μL擴增液與0.2 μL上樣緩沖液混勻，點樣于含0.8 μg/mL溴化乙錠的2%～3 %瓊脂糖凝膠中，70 V電泳約60～100 min后置于凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示LAMP特征性梯狀區帶，則判為陽性結果；如無任何區帶則結果為陰性。

1.2.4 酶切鑒定:取經電泳確定HPV-6陽性的擴增液和HPV-11陽性擴增液分別進行酶切分析，以位于HPV-6E6基因251～254 bp區域的AluI和位于HPV-11E6基因156～159 bp區域的TaiI作為酶切位點進行酶切反應。而后取2.5 μL酶切液進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 染色反應與結果判斷:向每只反應杯里剩余的擴增液中加入熒光染料SYBR Green Ⅰ 1.0 μL，混勻，置紫外燈下觀察結果。反應混合物變綠為陽性；保持 SYBR Green Ⅰ的橙色不變為陰性。

1.2.6 LAMP敏感性分析:260 nm測定HPV DNA提取液的DNA濃度，調整濃度為1.0×104mg/L，10倍系列稀釋為10×10-1～10×10-6mg/L 6個濃度，分別用LAMP和PCR檢測。

2 結果

2.1 電泳結果:用HPV-6LAMP引物檢測6例HPV-6/HPV-11陽性臨床標本，臨床標本①，②，③，④和⑤出現LAMP梯狀區帶(圖1)；用HPV-11 LAMP引物檢測6例PV-6/HPV-11陽性臨床標本①，②，⑤和⑥出現LAMP梯狀區帶(圖2)。4例陰性對照標本均未見任何區帶。

1.100 bp DNA marker; 2～7.HPV-6/11 positive samples ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥; 8.negative control圖1 HPV-6 LAMP引物擴增HPV6/11電泳圖Fig 1 The specificity of HPV-6 LAMP primer-amplified HPV-6/11 electrophoretogram

1.100b p DNA marker; 2～7.HPV-6/11 positive samples ①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥; 8.negative control圖2 HPV-11 LAMP引物擴增HPV6/11電泳圖Fig 2 The specificity of HPV-11 LAMP primer-amplified HPV-6/11 electrophoretogram

2.2 酶切結果:取HPV-6 LAMP液④和HPV-11 LAMP液⑥分別進行酶切分析，AluI酶切片段有：139、70、118和11 bp。TaiI酶切片段有：196、160、144和25 bp。

2.3 染色結果:6例HPV陽性標本擴增液均顯綠色，為陽性。4個對照標本擴增液均無顏色變化，為陰性。

2.4 LAMP敏感性分析結果:LAMP和PCR檢測HPV-6、HPV-11的敏感性均為10×10-6mg/L。

3 討論

尖銳濕疣在歐美國家已居性傳播疾病的首位，在我國居第2位，成為人們關注的社會公共問題之一。因此，HPV DNA的檢測對流行病學的調查和公共健康問題具有重要的價值。目前HPV的檢測幾乎依賴于分子生物學方法檢測其基因, PCR法比較費時且需要特殊的儀器，因此在臨床推廣應用上受到限制[3]。本研究收集了6例經熒光PCR鑒定過的HPV陽性臨床標本，檢測發現該6例HPV陽性標本中檢測出標本③和④僅HPV-6陽性，標本⑥僅HPV-11陽性，此外，標本①，②和⑤為HPV-6和HPV-11雙陽性。表明此3例存在HPV-6和HPV-11兩型病毒同時感染。取HPV-6 LAMP產物④和HPV-11 LAMP產物⑥分別進行酶切鑒定，酶切電泳結果與理論預計相符。染色反應顯示6例HPV陽性標本均為陽性，4例對照標本均為陰性。敏感性實驗結果顯示LAMP檢測HPV-6和HPV-11DNA的最低濃度可達10×10-6mg/L水平，其敏感性與PCR相當。以上結果顯示該法不僅可區別HPV型別，而且具有較高的特異性與敏感性，可作為HPV的快速檢測方法推廣應用。

[1] Chitladda S, Temduang L, Patcharee J,etal. Rapid detection of the most common high-risk human papillomaviruses by loop-mediated isothermal amplification [J]. J Viro Methods, 2011, 178: 22-30.

[2] Luo L, Nie K, Yang MJ.etal. Visual detection of high-risk human papillomavirus genotypes 16, 18, 45, 52, and 58 by loop-mediated isothermal amplification with hydroxynaphthol blue dye [J]. J Clin Microbiol, 2011, 49: 3545-3550.

[3] Kawai Y, Miyashita N, Kishi F,etal. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for the rapid detection of Chlamydophila pneumoniae [J]. J Clin Microbiol Infect Dis, 2009, 79: 605-615.

2013-02-06

2013-05-02

2011年度湖南省普通高校科學研究課題(11C0975)

*通信作者(correspondingauthor)： lyf155@263.net

1001-6325(2014)01-0113-02

Q 939.4

A