促紅細胞生成素抑制AngⅡ誘導的大鼠心肌細胞肥大及其可能的信號通路

趙金紅，王 偉，張新金，李建美

(云南省第二人民醫院 心內科， 云南 昆明 650021)

促紅細胞生成素抑制AngⅡ誘導的大鼠心肌細胞肥大及其可能的信號通路

趙金紅，王 偉，張新金*，李建美

(云南省第二人民醫院 心內科， 云南 昆明 650021)

目的觀察促紅細胞生成素(EPO)對新生大鼠心肌細胞肥大中信號通路蛋白表達的影響。方法用血管緊張素Ⅱ(AngⅡ, 10-6mol/L)誘導心肌細胞肥大，分別以EPO(2×104U/L)或/和P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑SB203580(15 μmol/L)進行干預，檢測心肌細胞表面積、蛋白合成、胚胎基因ANF及β-MHC表達，Real-time-Q-PCR檢測轉化生長因子β(TGF-β)1及P38MAPKmRNA表達；Western blot法檢測TGF-β1、TGF-β激活性激酶1(TAK1)、phospho-TAK1、P38MAPK和phospho-P38MAPK蛋白的表達。結果EPO能有效抑制AngⅡ誘導的心肌細胞肥大(Plt;0.05)，抑制TGF-β1、TAK1、phospho-TAK1、P38MAPK和phospho-P38MAPK表達(Plt;0.05)；SB203580能增強EPO抑制心肌細胞肥大的作用。結論EPO能減輕AngⅡ誘導的心肌細胞肥大，其可能與TGF-β1-TAK1-P38 MAPK信號通路有關。

促紅細胞生成素，心肌細胞肥大，TGF-β1，TAK1，P38MAPK

心肌細胞肥大是心臟重構的重要環節，成體心肌細胞在遭受病理刺激時通過各種信號途徑介導心肌細胞發生肥大,即心肌細胞面積及蛋白合成增加，而心肌細胞數量并不相應增加，同時伴隨心肌胚胎基因的激活[1-4]。促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)已被眾多研究證實具有心臟保護作用，它通過介導不同細胞內信號傳導機制抑制心肌細胞肥大。本研究通過血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)誘導心肌細胞肥大探討轉化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)1- TGF-β激活性激酶1(TGF-beta-activated kinase 1,TAK1)-P38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)信號通路在EPO抑制心肌肥大中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

1～3日齡SPF級SD鼠15只(昆明醫科大學實驗動物中心提供,許可證號:SCXKC滇2011- 0004)，雌雄不限。

1.2 主要試劑

胎牛血清(Gibco公司)，AngⅡ及EPO(Merck公司)，Ⅱ型膠原蛋白酶、5-溴脫氧尿苷(5-BrdU)及SB203580(Sigma公司)，[3H]-亮氨酸(北京原子高科公司)，TGF-β1兔抗鼠多克隆抗體(Santa Crusz公司)，TAK1、P38MAPK及其磷酸化兔抗鼠單克隆抗體(Epitomics公司)，β-actin小鼠抗大鼠抗體(Abmart公司)。磷酸酶抑制劑(Roche公司)，蛋白提取、BCA定量及Western blot試劑(北京碧云天公司)，Gel DoxTMXR+凝膠成像系統(BIO-RAD公司)；RNA提取及PCR試劑(大連寶生物公司)，引物由上海生工生物公司合成，引物ANF序列為：上游5′-GGCTCCTTCTCCATCACCAA-3′，下游5′-GGGC TCCAATCCTGTCAATC-3′，片段長度415 bp；β-MHC序列：上游5′-CCTTCCTGCGAAAATCTGAG-3′，下游5′-GGTAGGCAGCTACCACTTGC-3′，片段長度387 bp；TGF-β1序列：上游5′-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3′，下游5′-GTTTGGGACTGATCCCATTG-3′，片段長度149 bp；P38MAPK序列：上游5′-ATGACGAAATG ACCGGCTAC-3′，下游5′-ACAACGTTCTTCCGGTCA AC-3′，片段長度141 bp；GAPDH序列：上游5′-GAC AACTTTGGCATCGTGGA-3′，下游5′-ATGCAGGGAT GATGTTCTGG -3′，片段長度133 bp。

1.3 心肌細胞的分離培養

按文獻[5]描述的方法加以改進培養乳鼠心肌細胞。0.1%胰蛋白酶及0.5 g/L Ⅱ型膠原蛋白酶聯合消化分離心肌細胞[1]。在含20%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養液中加入100 μmol/L的5-BrdU以抑制非心肌細胞的增殖，差速貼壁1 h除去非心肌細胞后于37 ℃、5% CO2培養箱培養。

1.4 實驗分組及藥物干預

取原代培養7～8 d后同步化培養24 h的心肌細胞隨機分為5組，空白對照組(control)：心肌細胞培養；EPO組、AngⅡ組、AngⅡ+EPO組及AngⅡ+EPO+SB203580組分別加入EPO、AngⅡ、EPO及AngⅡ培養、EPO與SB203580及AngⅡ培養。EPO及SB203580需提前加入處理1 h后再按分組加入AngⅡ處理30 min/48 h 結束實驗，各組加入EPO、AngⅡ及SB203580濃度分別為2×104U/L、10-6mol/L及15 μmol/L[1,6]。

1.5 心肌細胞面積的計算

1.6[3H]-亮氨酸滲入測定心肌細胞蛋白含量

收集細胞前12 h按3.7×1010mBq/L培養基加入[3H]-亮氨酸,操作參照文獻[2]的方法，實驗重復4次，單位用count/min。

1.7PCR及實時熒光定量PCR(RT-Q-PCR)反應檢測相關基因mRNA表達

藥物處理48 h后按TrizolTM試劑盒說明書提取總RNA，測定RNA的濃度和純度，取1 μg總RNA反轉錄合成cDNA，取2 μL cDNA為模板，分別以ANF、β-MHC和GAPDH的引物擴增，反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火；72 ℃延伸30 s；分別進行35個循環，72 ℃延伸5 min。取PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，Gel DoxTMXR+凝膠成像系統獲取圖像，以檢測基因與內參吸光度比值作為產物的相對表達量，實驗重復3次。取5 μL cDNA稀釋4倍后，取2 μL做模板，分別以TGF-β1、P38MAPK和GAPDH的引物進行RT-PCT，條件為：95 ℃變性30 s；95 ℃變性10 s、60 ℃退火/延伸30 s，重復40個循環；65～95 ℃每增加0.5 ℃進行5 s讀板，形成溶解曲線。所有樣品均設置3個平行管，基因表達量以平行管平均循環閾值(cycle- threshold,Ct)表示。應用2-ΔΔCt法計算TGF-β1和P38MAPKmRNA的相對表達量，實驗重復3遍。

1.8細胞總蛋白提取和Westernblot檢測信號蛋白

藥物處理30 min后提取含磷酸化蛋白的總蛋白(裂解細胞時加入磷酸酶抑制劑)，處理48 h后提取總蛋白，按產品說明書用蛋白裂解液裂解30～60 min，4 ℃,12 000×g離心5 min獲得總蛋白，BCA法測濃度后各取30 μg蛋白在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，100 V恒壓轉膜60～90 min;5%脫脂奶粉/TBST室溫封閉1～2 h，1∶500 TGF-β1、1∶3 000 TAK1、1∶3 000 P38MAPK、1∶1 000 phospho-P38MAPK和1∶2 500 phospho-TAK1抗體4 ℃孵育過夜，1∶5 000 β-actin室溫孵育1.5 h，TBST洗膜10 min×3次，辣根酶標記的羊抗兔/鼠二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×2次，TBS洗膜5 min，ECL發光試劑盒顯色，顯影，Gel DoxTMXR+凝膠成像系統成像，取各條帶透光體積(Int)與內參條帶的比值作為目標蛋白相對表達量，實驗重復4次。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 心肌細胞面積測定

AngⅡ可使心肌細胞面積增大(Plt;0.05)，EPO和EPO+SB203580可使AngⅡ誘導細胞肥大的作用減弱(Plt;0.05)，SB203580使EPO抑制AngⅡ誘導心肌細胞肥大的作用加強(Plt;0.05)(表1)。

表1 心肌細胞面積Table 1 Surface area of cardiomyocytes(±s,n=4)

△Plt;0.05 compared with control；*Plt;0.05 compared with AngⅡ;#Plt;0.05 compared with AngⅡ+EPO.

2.2[3H]-亮氨酸滲入測定

用[3H]-亮氨滲入的方法可顯示心肌細胞的蛋白含量(圖1)。AngⅡ使心肌細胞內蛋白合成明顯增加(Plt;0.05)，EPO和EPO+SB203580可抑制AngⅡ誘導的蛋白合成增加(均為Plt;0.05)，SB203580可加強EPO的抑制蛋白合成作用(Plt;0.05)。

2.3 ANF及β-MHC基因表達

AngⅡ可使心肌細胞ANF和β-MHCmRNA表達增加(Plt;0.05)，EPO和EPO+SB203580可減弱AngⅡ誘導的ANF和β-MHCmRNA表達增加(Plt;0.05)(圖2)。

2.4 Real-time-Q-PCR檢測信號分子核酸表達

經AngⅡ誘導后的心肌細胞中P38MAPK和TGF-β1 mRNA表達量明顯升高(均為Plt;0.05)；EPO和EPO+SB203580處理后，P38MAPK和TGF-β1 mRNA表達量均較AngⅡ組明顯下降(均為Plt;0.05)(表2)。

△Plt;0.05 compared with control; *Plt;0.05 compared with AngⅡ;#Plt;0.05 compared with AngⅡ+EPO.圖1心肌細胞[3H]-leu滲入量的比較Fig 1 [3H]-leucine incorporation of cardiomyocytes

表2 TGF-β1及P38MAPK mRNA表達Table 2 TGF-β1 and P38MAPK mRNA expression

Quantitative analysis of TGF-β1 and P38MAPK mRNA expression by real-time PCR;the fold inductions over control are calculated as TGF-β1 and P38MAPK mRNA expression;*Plt;0.05 compared with control;#Plt;0.05 compared with AngⅡ.

A,B.representative electrophoretic image ofANFandβ-MHCmRNA expression respectively by PCR; M.marker; 1.control; 2.AngⅡ; 3.EPO; 4.AngⅡ+EPO; 5.AngⅡ+EPO+SB203580; C,D.representative quantitative analysis ofANFandβ-MHCmRNA expression respectively;△Plt;0.05 compared with control;*Plt;0.05 compared with AngⅡ

圖2ANF和β-MHCmRNA的表達
Fig2ANFandβ-MHCmRNAexpression

2.5 Western bolt檢測信號蛋白表達

AngⅡ可誘導TGF-β1、phospho-TAK1、phospho-P38MAPK、TAK1和P38MAPK蛋白表達明顯增加(均為Plt;0.05)；EPO可使該作用減弱(Plt;0.05)(圖3)。

3 討論

EPO通過介導各種信號傳導通路減輕心肌細胞凋亡，促進新生血管形成，抑制炎性反應，減輕間質纖維化程度，從而減輕心肌缺血再灌注損傷，縮小左室收縮容積，改善心臟射血功能[7-8]。本文用AngⅡ誘導大鼠心肌細胞肥大，后者可被EPO抑制，包括抑制心肌細胞面積增加及蛋白合成，使胚胎基因ANF及β-MHCmRNA表達下調。

各種原因誘導的心肌肥厚均伴有TGF-β1表達上調，AngⅡ持續注入TGF-β1基因敲除后的大鼠不發生心肌肥厚[3]。TGF-β1誘導P27Kip1基因表達,后者通過調節細胞周期使DNA增殖停止，而RNA及胞質合成卻增加，表現為細胞增殖受抑制但發生肥大[1]。TGF-β1在心肌肥大中發揮著關鍵作用，肥大刺激可通過介導TGF-β1使心肌細胞發生肥大[9-10]，TGF-β1單獨作用亦可使心肌細胞發生肥大[2]。EPO可抑制TGF-β1介導的心肌肥大作用[1]。

心肌梗死等刺激可誘導心肌細胞肥大，而RWJ(P38MAPK抑制劑)治療可減輕體內外刺激誘導的心肌肥大[11]。P38αMAPK基因顯性失活型糖尿病小鼠的左室心肌細胞肥大及ANP基因表達增加均較野生型糖尿病鼠明顯減弱，表明P38介導心肌細胞肥大[12]。TAK1作為P38MAPK的上游信號分子，可通過MKK3和MKK6激活P38MAPK，還可通過TAK1結合蛋白使P38MAPK活化[13]。TGFβ1可通過MAPK激酶家族成員-TAK1改變心肌基因表達，導致心肌肥大，研究發現與TGF-β1-TAK1-P38MAPK途徑激活相平行的心肌肥大標志基因β-MHC及ANP轉錄上調，因此TGF-β1可能通過TGF-β1-TAK1-MKK3/6-P38MAPK途徑導致心肌肥大[14]。

A:electrophoretic image of TGF-β1,phospho-TAK1,TAK1,phospho-P38 MAPK and P38 MAPK protein expression by Western blot; C.control; A.AngⅡ; E.EPO; AE.AngⅡ+EPO; AES.AngⅡ+EPO+SB203580; B,C,D,E,F:representative quantitative analysis of TGF-β1,phospho-TAK1,TAK1,phospho-P38 MAPK and P38 MAPK protein expression respectively;△Plt;0.05 compared with control;*Plt;0.05 compared with AngⅡ

圖3TGF-β1、phospho-TAK1、TAK1、phospho-P38MAPK及P38MAPK蛋白表達
Fig3TGF-β1,phospho-TAK1,TAK1,phospho-P38MAPKandP38MAPKproteinexpression

本實驗中TGF-β1、P38MAPKmRNA，TGF-β1、phospho-TAK1、phospho-P38MAPK、TAK1和P38MAPK蛋白在AngⅡ誘導心肌細胞肥大時表達明顯升高，而在EPO抑制心肌細胞肥大時則表達下降，提示TGF-β1-TAK1-P38MAPK信號通路激活參與心肌細胞肥大的發生[13]，EPO可能通過抑制TGF-β1-TAK1-P38MAPK信號途徑發揮抑制心肌肥大作用[14]。

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Erythropoietin attenuates Cardiomyocytes hypertrophy induced by Ang Ⅱ and its possible signal pathway in rats

ZHAO Jin-hong, WANG Wei, ZHANG Xin-jin*, LI Jian-mei

(Dept. of Cardiology, the Second People’s Hospital of Yunnan, Kunming 650021,China)

ObjectiveTo observe the effects of erythropoietin (EPO) on angiotensinⅡ (AngⅡ) induced neonatal rat cardiomyocyte hypertrophy and its signal protein expression.MethodsCardiomyocytes were isolated from new-born Sprague-Dawley rats and were used to establish the model of hypertrophy by AngIIinvitro.The cells were treated with EPO or/and P38MAPK inhibitor SB203580. The cell surface area size, [3H]-leucine incorporation,mRNA expression of atrial natriuretic factor(ANF) and β-myosin heavy chain(β-MHC) of cardiomyocytes were employed as indicators to measure cardiomyocyte hypertrophy. The mRNA levels ofTGF-β1 andP38MAPKwere analyzed by real-time quantitative PCR. The protein expression of TGF-β1,TAK1,P38MAPK and phosphorylation of TAK1 and P38MAPK were analyzed by Western blot.ResultsEPO attenuated hypertrophy of cardiomyocytes. EPO significantly suppressed TGF-β1,TAK1,P38MAPK,phosphrylation of TAK1 and P38MAPK expression. SB203580 represses cardiac hypertrophy.ConclusionsEPO attenuates cardiomyocytes hypertrophy induced by Ang II,and it is potentially associated with TGF β1-TAK1-P38MAPK signaling pathway.

erythropoietin; cardiocyte hypertrophy; TGF-β1; TAK1; P38MAPK

2013-02-27

2013-06-25

國家自然科學基金(30960138)；云南省自然科學基金(2009ZC176M)

*通信作者(correspondingauthor)： zxjgry2004@sina.com

1001-6325(2014)03-0295-06

研究論文

R 542.2

A