泛素連接酶MDM2促進外源NOLC1的泛素化和降解

王小蓉，郭正光，高友鶴

(中國醫(yī)學科學院 基礎醫(yī)學研究所 生理與病理生理系 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室， 北京 100005)

泛素連接酶MDM2促進外源NOLC1的泛素化和降解

王小蓉，郭正光*，高友鶴*

(中國醫(yī)學科學院 基礎醫(yī)學研究所 生理與病理生理系 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室， 北京 100005)

目的研究泛素連接酶MDM2對其調(diào)節(jié)因子NOLC1的泛素化和降解。方法克隆原核表達了NOLC1全長蛋白和其核定位信號區(qū)域，在體外泛素化體系中利用有泛素連接酶活性的重組MDM2研究其對NOLC1的泛素化。在哺乳動物細胞中，研究MDM2對外源轉(zhuǎn)染的NOLC1的降解。結(jié)果在體外泛素化體系中MDM2泛素化NOLC1全長和其核定位信號區(qū)域；在哺乳動物細胞中，MDM2促進外源NOLC1降解超過70%，且NOLC1的降解通過蛋白酶體途經(jīng)實現(xiàn)。結(jié)論MDM2促進外源NOLC1的泛素化和降解，為研究MDM2-TP53-NOLC1之間的相互調(diào)節(jié)提供了新的線索。

泛素連接酶；泛素化；MDM2；NOLC1

MDM2是一種重要的RING FINGER類單亞基泛素連接酶。MDM2基因最早從NIH3T3細胞系中分離出來，在小鼠腫瘤細胞中高表達[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)MDM2作為一種泛素連接酶， 參與著名抑癌基因P53/TP53的泛素化，并導致其通過蛋白酶體途經(jīng)降解[3-4]。 除了P53/TP53之外，近年研究還鑒定到更多MDM2的底物，包括CDKN1A、 HIPK2、RB1、CDH1、DLG4、IGF1R、APEX1、ADRBK1、ARRB、ARRB2、CREBBP、EID1、IRS1、JMY、KAT2B、KAT5、MDM4、NFATC2、NOL3、RPL26和MDM2自身[5]。MDM2作為一個癌基因，通過與其他蛋白相互作用，和泛素化它的底物參與許多細胞的生理和病理過程，包括細胞周期、細胞凋亡和腫瘤發(fā)生。

NOLC1是一個具有類轉(zhuǎn)錄因子活性的蛋白，參與細胞核組裝[6]和前體rRNA剪切[7]，參與細胞周期和細胞生長的調(diào)節(jié)[8]。NOLC1參與多種信號傳導通路，如NF-kB信號通路、PKA信號通路[9]和CK2的激活[10]。研究表明，NOLC1和P53協(xié)同作用激活MDM2的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活MDM2的表達[8]。

這項實驗研究了MDM2作為泛素連接酶是否能夠調(diào)節(jié)NOLC1的泛素化和降解。實驗利用有活性的重組人MDM2蛋白，在體外泛素化體系中研究其對NOLC1的泛素化，進而在細胞內(nèi)研究MDM2對外源轉(zhuǎn)染的NOLC1的泛素化和降解，為深入研究MDM2和NOLC1的調(diào)節(jié)提供了重要線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種和細胞：原核表達的載體：pET 32b+(Novagen，69016)。真核表達的質(zhì)粒載體：pEGFP-N1-NOLC1-GFP(Genechem)，它的DNA序列分別由BC006769模板獲得，克隆至pEGFP-N1載體中，編碼C末端GFP標簽的NOLC1全長蛋白。 Flag-MDM2(GeneCopoeia)，它的DNA序列由IMAGE: NM_002392.1模板獲得，克隆至pReceiver-M11載體中，編碼N末端Flag標簽的MDM2全長序列。HA-ubiquitin載體由原醫(yī)科院基礎所李匯華教授惠贈。大腸桿菌菌株BL21(DE3)(全式金公司)。HEK293T細胞由本實驗室保存。

1.1.2 試劑、抗體和酶：MagExtractor (His-tag)(NPK-701)(Toyobo公司)；E1(重組人UBE1)(E-305)、E2(重組人UbcH5b蛋白)(E2-622)、E3 (重組人GST-Hdm2)(E3-202)、His-ubiquitin(U530)和Myc-ubiquitin(U-115)(Boston Biochem公司)。GST蛋白為本實驗室表達純化。轉(zhuǎn)染試劑：I’ma Fect (IMA201101)(Imagen公司)；MG132(Beyotime, S1748)(碧云天公司)；RIPA lysis緩沖液(Applygen, P1053)(普利萊公司)。

抗體：anti-S-tag (Abcam, ab18616)、anti-Flag-tag (DYKDDDDK) (M20008)、anti-Myc-tag(M20002)、anti-GFP-tag (M20004)、anti-HA-tag(M20003)和anti-β-actin (M20010)(Abmart公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 表達載體的構(gòu)建:設計引物：以IMAGE克隆IMAGE: NM_002392.1為模板，將MDM2全長(1～491aa)和MDM2ΔRing(1～435aa)PCR擴增出來，PCR產(chǎn)物用BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切，連接到pcDNA6載體上。設計引物，以pEGFP-N1-NOLC1-GFP為模板，將NOLC1全長和NOLC1的核定位信號區(qū)域(386～605aa)PCR擴增，PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切，連接到PET32b+載體上。上述連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，挑取單克隆，PCR鑒定，最后送交公司測序確定編碼序列和讀碼框架無誤。

1.2.2 潛在底物NOLC1的表達和純化: 分別將底物的表達質(zhì)粒與PET32b+轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，分別挑取單克隆，37 ℃振蕩過夜，再取200 μL加入到4 mL新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h至指數(shù)生長期，再加入0.2 mmol/L 異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導劑30 ℃誘導蛋白表達4～6 h，離心，收集細胞，用PBS洗1次，菌體超聲破碎(160 W，10 s/10 s)，離心去沉淀，上清液用Mag Extractor (His-tag) 試劑盒富集表達蛋白。富集后的蛋白用考馬斯亮藍法(Bradford法)定量。

1.2.3 體外泛素化反應:體外泛素化體系包括以下成分：110 ng E1(Boston Biochem, 662070)、0.5 μg E2(重組UbcH5b)(UpState, 14～871)、0.83 μg E3(重組GST-MDM2/或GST)、3 mmol/L ATP、4 μg His-ubiquitin(Boston Biochem,U5507)、50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)、2.5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DTT和200 ng底物。反應體系用去離子水補齊至20 μL。在30 ℃反應90 min后，用5×SDS上樣緩沖液終止反應。反應產(chǎn)物95 ℃處理5 min，反應混合物用SDS-PAGE膠分離，濕式轉(zhuǎn)膜，用anti-S-tag 抗體進行蛋白免疫印跡，顯色分析。

1.2.4 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:真核表達質(zhì)粒用I’ma Fect轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中。轉(zhuǎn)染后24～48 h收獲細胞，用RIPA裂解液裂解(含2 mmol/L苯甲基磺酰氟PMSF)，澄清的細胞裂解液通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠分離，用相應的抗體免疫印跡。在需要蛋白酶體抑制劑的實驗中，轉(zhuǎn)染的細胞在收獲前用10 μmol/L的MG132處理12 h。NOLC1和內(nèi)參分別Image J定量并計算標準化比值。

2 結(jié)果

2.1 泛素連接酶活性測定

有活性的RING finger類的E3可以在含有E1和E2的體外泛素化反應體系中，催化游離的泛素聚合成不同分子質(zhì)量大小的泛素鏈。重組 GST-MDM2確實具有泛素連接酶活性(圖1)。

圖1 重組MDM2具有泛素連接酶活性Fig 1 Recombinant MDM2 has ubiquitin ligase activity

2.2 體外泛素化實驗

在體外泛素化體系中，MDM2可以促進NOLC1核定位信號區(qū)域(386～605aa)的多聚泛素化(圖2A)；MDM2同樣可以促進NOLC1的全長產(chǎn)生泛素化條帶，但泛素化程度較NOLC1片段低(圖2B); MDM2不能使陰性對照(PET32b+空載體表達產(chǎn)物)泛素化(圖2C)。

2.3 MDM2促進NOLC1通過蛋白酶體途經(jīng)降解

細胞內(nèi)泛素化的蛋白質(zhì)通常通過蛋白酶體途經(jīng)降解。在HEK293T細胞中，NOLC1主要以截斷體形式存在。MDM2的過表達導致外源轉(zhuǎn)染的NOLC1的降解超過70%，10 μmol/L蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞12 h后，可以明顯抑制NOLC1的降解(圖3)。

3 討論

這項研究利用體外泛素化體系和哺乳動物泛素化體系，發(fā)現(xiàn)MDM2可以泛素化NOLC1并導致外源轉(zhuǎn)染的NOLC1通過蛋白酶體途徑降解。在體外泛素化的實驗中，發(fā)現(xiàn)商品化的人重組MDM2蛋白具有E3活性，可以用于后續(xù)研究。研究還發(fā)現(xiàn)，人重組MDM2可以泛素化NOLC1全長蛋白和NOLC1的核定位信號區(qū)域。這一研究結(jié)果提示，MDM2可能通過識別NOLC1的核定位信號區(qū)域并導致NOLC1泛素化。而MDM2對NOLC1全長的泛素化程度比NOLC1片段低，這可能是NOLC1全長的其他區(qū)域產(chǎn)生了空間位阻效應，阻礙了其與NOLC1的相互識別。MDM2對NOLC1的泛素化具體機制需要進一步深入研究，如MDM2與NOLC1的相互作用位點的確定，MDM2泛素化NOLC1的泛素化修飾位點的確定。

A.MDM2 promoted the ubiquitinaition of the nuclear localization signal of NOLC1; B.MDM2 promoted the ubiquitination of NOLC1 full-length protein; C.MDM2 could not ubiquitinate the negative control

圖2在體外泛素化體系中MDM2促進NOLC1泛素化
Fig2MDM2promotedtheubiquitinationofNOLC1ininvitroubiquitinationsystem

圖3 MDM2促進外源轉(zhuǎn)染的NOLC1通過蛋白酶體途徑降解Fig 3 MDM2 promotes the proteosomal degradation of exogenous NOLC1

MDM2是一種非常重要的泛素連接酶，已有發(fā)現(xiàn)它可以泛素化多種底物，包括：TP53[3-4]和RB1[11-13]等，參與多種細胞的生理和病理過程，包括細胞周期、細胞凋亡和腫瘤發(fā)生。在NPC細胞中，NOLC1和TP53協(xié)同作用，共同激活MDM2的啟動子，促進MDM2的表達，進而參與NPC細胞的腫瘤發(fā)生和調(diào)節(jié)[8]。然而MDM2對NOLC1的調(diào)節(jié)尚不清楚。NOLC1是一個具有類轉(zhuǎn)錄因子活性的蛋白，參與細胞核組裝[6]和前體rRNA剪切[7]，參與細胞周期和細胞生長的調(diào)節(jié)。

這項研究發(fā)現(xiàn)MDM2可以促進外源的NOLC1的泛素化和降解，推測MDM2很有可能通過對NOLC1的泛素化抑制NOLC1，這一現(xiàn)象為MDM2-TP53-NOLC1之間的相互調(diào)節(jié)提供了新的線索。

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Ubiquitin ligase MDM2 promotes ubiquitination and degradation of exogenous NOLC1

WANG Xiao-rong, GUO Zheng-guang*, GAO You-he*

(National Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Dept. of Physiology and Pathophysiology,Institute of Basic Medical Sciences, CAMS amp; PUMC, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo study the role of MDM2 in the ubiquitination of NOLC1, a regulator of MDM2.MethodsFull-length NOLC1 proteins and its nuclear localization signal region were cloned and expressed in E.coli. Recombinant human MDM2 with ubiquitin ligase activity was used to study the ubiquitination of NOLC1 by MDM2 ininvitroubiquitination system. The degradation of exogenous NOLC1 by MDM2 was studied in mammalian cells.ResultsMDM2 promoted the ubiquitination of full-length NOLC1 proteins and its Nuclear localization signal region ininvitroubiquitination system. MDM2 promoted the proteasome dependent degradation of exogenous NOLC1 by over 70% in mammalian cells.ConclusionsUbiquitin ligase MDM2 promotes the ubiquitination and degradation of exogenous regulator NOLC1, which provides important clues for the rescarch on regulation of MDM2-TP53-NOLC1.

ubiquitin ligase; ubiquitination; MDM2; NOLC1

2013-09-26

2013-12-16

國家基礎研究計劃(973)(2012CB517606, 2011CB964901, 2013CB530805)；國家高技術研究發(fā)展計劃(863)(2011AA020116)；高校長江學者創(chuàng)新研究團隊(IRT0909)；111計劃(B08007)

*通信作者(correspondingauthor)：gaoyouhe@pumc.edu.cn ；gzg0625@gmail.com

1001-6325(2014)03-0314-04

研究論文

R34

A