RhoA/Rho激酶在2型糖尿病大鼠肝臟纖維化中的作用

房彩霞，周 紅*，李貴芝，王德峰，王 綿

(1.河北醫科大學 第二醫院 內分泌科， 河北 石家莊 050000；2.河北工程大學 附屬醫院 內分泌科， 河北 邯鄲 056002)

RhoA/Rho激酶在2型糖尿病大鼠肝臟纖維化中的作用

房彩霞1，周 紅1*，李貴芝1，王德峰2，王 綿1

(1.河北醫科大學 第二醫院 內分泌科， 河北 石家莊 050000；2.河北工程大學 附屬醫院 內分泌科， 河北 邯鄲 056002)

目的闡明RhoA/Rho激酶在糖尿病大鼠肝纖維化中的作用。方法通過高脂飲食和小劑量鏈脲佐菌素(STZ，30 mg/kg)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型。實驗分為對照組、糖尿病組和法舒地爾干預組(法舒地爾10 mg/(kg·d)，分兩次腹腔注射)24周末。測定血糖、血脂、谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶；Masson染色和羥脯氨酸測定評估肝膠原沉積；RT-PCR測定轉化生長因子β1(TGF-β1)和結締組織生長因子(CTGF)mRNA表達；免疫組化測定TGF-β1蛋白表達；Western blot測定肝組織肌球蛋白磷酸酯酶靶點亞單位1磷酸化(p-MYPT1)水平。結果與對照組比較，糖尿病組大鼠血糖、血脂和轉氨酶顯著增高，肝組織大量膠原沉積，p-MYPT1水平、TGF-β1與CTGF mRNA表達顯著上調(Plt;0.01)。與糖尿病組比較，法舒地爾干預組大鼠轉氨酶降低，肝膠原沉積明顯減輕，p-MYPT1水平、TGF-β1與CTGF mRNA表達顯著下降(Plt;0.01)。結論高血糖激活了肝組織RhoA/Rho激酶，通過調控 TGF-β1/CTGF表達，在糖尿病肝纖維化中起著重要作用。

糖尿病肝纖維化；Rho激酶；轉化生長因子β1；結締組織生長因子；法舒地爾

糖尿病能夠引起多種慢性并發癥，除了大血管和微血管病變，糖尿病肝臟損傷，尤其肝纖維化已日益受到學者們的關注。糖尿病引起的肝臟病變在早期主要表現為非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver NAFLD)，進一步發展為非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis NASH)，肝纖維化，甚至進展為不可逆轉的肝硬化[1]。糖尿病肝臟病變的分子機制還不十分明確，臨床上除了對代謝的改善，尚未找到能夠阻止肝病發生、發展的有效藥物。Rho是小分子的鳥苷酸結合蛋白，Rho激酶(ROCK)是RhoA下游最主要的效應分子。近年的研究發現RhoA/ROCK信號通路的過度激活參與了多種組織結構的重塑[2-4]，并且在糖尿病慢性并發癥的發生、發展過程中起了重要作用[5]。研究也證實轉化生長因子β1(transforming growth factor β1 TGF-β1)能夠激活肝星狀細胞并促進表達細胞外基質，在肝臟損傷中發揮著重要作用[6-7]。結締組織生長因子(connective tissue growth factor CTGF) 是TGF-β1的下游效應器，TGF-β1的促組織纖維化作用可能是通過誘導CTGF的表達來實現的[8]。目前RhoA/ROCK通路與TGF-β1/CTGF通路的關系以及在糖尿病肝損傷中的作用國內外尚為鮮見。

本研究通過高脂飲食結合小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin STZ，30 mg/kg)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，探討RhoA/ROCK在2型糖尿病肝纖維化中的作用，旨在為糖尿病肝臟病變的防治提供一個新的策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

1.2 方法

1.2.1 動物及模型的建立：清潔級健康雌性SD大鼠[河北醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(冀)2012-1-003，動物質量合格證編號：1010399]42只，體質量約180～200 g，按清潔級大鼠要求飼養。建立2型糖尿病模型[2]，10周末行高胰島素正常血糖鉗夾實驗[9]。計算葡萄糖輸注速率(glucose infusion rate, GIR)，用以評價組織對胰島素的敏感性。取血測空腹血糖(FBG)、胰島素(FINS)、膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)；每周測體質量(BW)。將大鼠隨機分為對照組(NC)、糖尿病組(DM)和法舒地爾干預組(FAS)(法舒地爾10 mg/kg·d, ip.)，繼續喂養14周。

1.2.2 血代謝指標和肝功能測定：第24周末，取血測定FBG、FINS、TC、TG、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)和糖化血紅蛋白(HbA1c)。根據公式計算胰島素抵抗指數 HOMA-IR=FBG*FINS/22.5。

1.2.3 肝組織結構和膠原沉積：快速取出肝臟，4%多聚甲醛溶液固定用于HE染色觀察肝組織結構，Masson染色觀察膠原沉積。按照羥脯氨酸試劑盒說明書要求測定膠原含量。

1.2.4 免疫組化檢測肝組織TGF-β1蛋白表達：一抗為兔抗大鼠TGF-β1抗體，1∶100稀釋，二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG，陰性對照一抗用PBS緩沖液。按試劑盒說明染色，中性樹膠封片。細胞內有棕黃色顆粒彌漫分布者為陽性反應。

1.2.5 RT-PCR測定肝組織TGF-β1和CTGF mRNA表達：用Trizol提取肝臟組織總RNA，用Rotor-gene 3000熒光定量PCR儀測定A260/A280和RNA濃度。取3 μg RNA在M-MLV反轉錄酶作用下合成單鏈的cDNA; 取1 μL cDNA在PCR儀上進行擴增反應。TGF-β1上游引物序列：5′-CCAAGGAGACGGA ATACAGG-3′；下游引物序列：5′-GTGTTGGTTGTA GAGGGCAAG-3′；擴增產物長度為411 bp。CTGF上游引物序列：5′-GGCAGGGCCAACCACTGTGC-3′；下游引物序列：5′-CAGTGCACTTGCCTGGATGG-3′；擴增產物長度為167 bp。β-actin上游引物序列為5′-GAGACCTTCAACACCCAGCC-3′；下游引物序列為5′-GCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3′；擴增產物全長374 bp。反應條件為：95 ℃預變性5 min；PCR擴增95 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共進行30個循環；循環結束后72 ℃延伸5 min。取PCR產物10 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳35 min，凝膠圖像分析系統進行吸光度掃描。結果用目的基因與β-actin吸光度的比值表示。

1.2.6 Western blot測定磷酸化MYPT1(p-MYPT1)：肝組織勻漿，提取蛋白、電泳和轉膜。膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉液封閉1.0～1.5 h，加入TBS稀釋(1∶500)的兔抗大鼠磷酸化MYPT1(Thr696)多克隆抗體，并4 ℃孵育過夜，沖洗。加入熒光二抗(1∶10 000)，孵育2～4 h。用TBST洗膜后放入雙色紅外熒光掃描成像系統上進行分析，磷酸化MYPT1水平以p-MYPT1與MYPT1的比值表示。

國家之強弱，視教育發達與否為標準。東西各國規定義務教育，凡學齡兒童已達就學之期，非有不得已事故不得廢學，否則罪其父母，此教育之所以溥及而國乃以強盛。方今民國初定，百端待理，顧尤以普及教育為根本之要圖。而謀普及教育，須從調查學齡兒童入手，某地應添設學校幾所，某地應需經費若干，種種設施，皆恃是以為準則。而以學齡兒童之人數比較就學差數之多少，尤足覘各地文化之遲速。[13]

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 血生化指標和BW

10周末，糖尿病大鼠FBG、FINS、TG、TC和BW顯著高于對照組(Plt;0.01，Plt;0.05)(表1)。24周末，糖尿病組大鼠的FBG、FINS、TG、TC、HbA1c、ALT和AST較對照組大鼠顯著升高(Plt;0.01)，法舒地爾干預組大鼠的FBG、FINS、TG、TC和HbA1c與糖尿病組大鼠無差異，但ALT和AST較糖尿病組大鼠顯著降低(Plt;0.01)；糖尿病組大鼠的BW較對照組大鼠顯著降低(Plt;0.05)，與法舒地爾干預組大鼠無差異(表2，3)。

2.2 胰島素敏感性指標

第10周末，血糖鉗夾實驗顯示糖尿病大鼠GIR顯著低于對照組大鼠(Plt;0.01)(表1)。第24周末，糖尿病和法舒地爾干預組大鼠的HOMA-IR顯著高于對照組(Plt;0.01)；糖尿病組和法舒地爾干預組大鼠HOMA-IR無差異性(Pgt;0.05)(表2)。

2.3 HE染色結果

對照組大鼠肝小葉結構正常，肝細胞排列整齊，中央靜脈周圍呈放射狀分布。肝細胞大小、形態正常，核結構清晰；糖尿病組大鼠肝小葉結構破壞，肝索排列紊亂，肝細胞明顯腫脹，胞質內可見大小不等的球形脂滴，呈空泡變性，伴有炎性細胞的浸潤，中央靜脈周圍可見纖維組織增生；法舒地爾干預組上述改變均較糖尿病組明顯減輕(圖 1)。

表1 10周末各組大鼠血生化、GIR和BW指標Table 1 Changes of biochemical index, GIR and BW at week 10(±s, n=6)

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with control rats.

表2 24周末各組血生化指標Table 2 Changes of biochemical index at week 24(±s, n=8)

*Plt;0.01 compared with NC group.

2.4 Masson染色和膠原含量

對照組大鼠血管壁可見少量被染成綠色的膠原纖維；糖尿病組大鼠中央靜脈周圍可見大量膠原纖維，膠原面密度為0.083±0.109，顯著高于對照組的0.051±0.008(Plt;0.01)；法舒地爾干預組顯著回降至0.059±0.009 (Plt;0.01) (圖2)。糖尿病組大鼠肝臟膠原含量顯著高于對照組大鼠(Plt;0.01)；法舒地爾干預組大鼠的膠原含量顯著回降(Plt;0.01)(表3)。

2.5 免疫組化染色結果

對照組大鼠肝組織中TGF-β1呈弱陽性表達。糖尿病組大鼠肝組織中TGF-β1廣泛表達，呈棕黃色顆粒，陽性面積為0.231±0.104%，顯著高于對照組0.169±0.100%(Plt;0.01)；法舒地爾干預組顯著回降至0.178±0.08%(Plt;0.01)(圖3)。

2.6 基因表達結果

糖尿病組大鼠肝組織TGF-β1和CTGF mRNA表達較對照組顯著上調(Plt;0.01)；法舒地爾干預組大鼠肝組織TGF-β1和CTGF mRNA表達顯著回降(Plt;0.01)(圖4)。

2.7 蛋白表達結果

磷酸化MYPT1水平代表ROCK的活性。糖尿病組大鼠肝組織磷酸化MYPT1水平較對照組大鼠顯著增加(Plt;0.01)；法舒地爾干預組大鼠肝組織磷酸化MYPT1水平顯著回降(Plt;0.01)(圖5)。

A.control rats; B.diabetic rats; C.fasudil-treated rats圖1 肝組織HE染色特征Fig 1 The features of HE-staining in liver tissue of different groups (×200)

A.control rats; B.diabetic rats; C.fasudil-treated rats; Liver tissues from the diabetic rats show regions of fibrosis (blue) in the interstitium

圖2 肝組織Masson染色的結果Fig 2 The result of Masson-staining in liver tissue of different groups (×400)

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with NC group；#Plt;0.01 compared with DM group.

A.control rats; B.diabetic rats; C.fasudil-treated rats; a brown color denotes positive staining圖3 肝組織TGF-β1免疫化學染色結果Fig 3 Immunostaining for TGF-β1 in the liver tissues of different groups (×200)

A.tThe expression of TGF-β1 mRNA in liver tissues; B.the expression of CTGF mRNA in liver tissues;*Plt;0.01 compared with NC group;#Plt;0.01 compared with DM group

3 討論

近年來動物實驗和臨床研究都證實糖尿病可以促進肝纖維化的發生，發展。在糖尿病患者中，終末期肝病的死亡率比心血管疾病高[10]。本研究發現24周末，糖尿病組大鼠的ALT、AST水平顯著增高，肝細胞出現明顯的脂肪變性及中央靜脈周圍大量膠原纖維沉積，且膠原含量顯著增加，這些結果都證實糖尿病大鼠發生了肝纖維化，這與Paradis等人的研究結果相一致[11-13]。

Rho是小分子鳥苷酸結合蛋白，是Ras超家族成員之一，起著“分子開關”的作用。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是RhoA下游最主要的效應分子，通過促進肌動蛋白微絲骨架的聚合，調控著細胞收縮、黏附、遷移、形態改變以及增殖等多種生物學行為和功能，同時RhoA/ROCK通路位于多種信號分子的上游，調控著多種信號通路和基因表達[5]。有研究顯示RhoA/ROCK在肝星形細胞增殖及膠原合成中起了重要作用[14]。TGF-β1是最重要的促纖維化生長因子，CTGF是TGF-β1的下游效應器，介導了TGF-β1促細胞增殖和細胞外基質合成的負面效應[15]。

The phosphorylation of MYPT1 (p-MYPT1) and total MYPT1 were measured by western blot analyses; The extent of MYPT1 phosphorylation was quantified by p-MYPT1/MYPT1;*Plt;0.01 compared with NC;#Plt;0.01 compared with DM

本研究發現，糖尿病組大鼠的肝組織MYPT1磷酸化水平升高，ROCK活性增強，同時糖尿病組大鼠肝組織TGF-β1 mRNA和蛋白表達增加，CTGF mRNA表達上調。應用ROCK特異性抑制劑法舒地爾干預后，不僅抑制了ROCK的活性，也抑制了TGF-β1/CTGF的表達，改善了肝纖維化，肝功能亦恢復正常。這些結果提示高糖激活了肝組織上RhoA/ROCK通路，可能通過調控TGF-β1/CTGF的表達從而介導了肝纖維化的發生。有研究報道ROCK抑制劑Y-27632在CCl4介導的急性肝損傷能夠降低血清轉氨酶水平，通過抑制ROCK的活性起到了肝細胞的保護作用[16-17]。研究中還發現法舒地爾對糖尿病大鼠的血糖、血脂和胰島素抵抗沒有影響，這意味著法舒地爾的肝保護作用是不依賴于代謝改善的，這與糖尿病心肌纖維化和腎病的研究結果相一致[2, 4]。

本研究證實高糖激活了肝臟RhoA/ROCK通路，在2型糖尿病大鼠肝纖維化中起著重要作用，ROCK有可能成為糖尿病肝纖維化新的治療靶點。法舒地爾是目前唯一能應用于臨床的ROCK抑制劑[18]，臨床研究正在證實法舒地爾在心、腦血管疾病方面的獲益，本研究為更深地理解和治療糖尿病肝臟病變提供了一個理論依據。

[1] Ismail, MH. Nonalcoholic fatty liver disease and type 2 diabetes mellitus: the hidden epidemic [J]. Am J Med Sci, 2011,341:485-492.

[2] Zhou H, Li YJ, Wang M,etal. Involvement of RhoA/ROCK in myocardial fibrosis in a rat model of type 2 diabetes [J]. Acta Pharmacol Sin, 2011, 32: 999-1008.

[3] Murata T, Arii S, Nakamura T,etal. Inhibitory effect of Y-27632, a ROCK inhibitor, on progression of rat liver fibrosis in association with inactivation of hepatic stellate cells [J]. J Hepatol, 2001, 35: 474-481.

[4] Kolavennu V, Zeng L, Peng H,etal. Targeting of RhoA/ROCK signaling ameliorates progression of diabetic nephropathy independent of glucose control [J]. Diabetes, 2008, 57: 714-723.

[5] Zhou H, Li YJ. Long-term diabetic complications may be ameliorated by targeting Rho kinase [J]. Diabetes Metab Res Rev, 2011, 27: 318-330.

[6] Liu X, Hu H, Yin JQ. Therapeutic strategies against TGF-beta signaling pathway in hepatic fibrosis [J]. Liver Int, 2006, 26: 8-22.

[7] Cutroneo KR. TGF-beta-induced fibrosis and SMAD signaling: oligo decoys as natural therapeutics for inhibition of tissue fibrosis and scarring [J]. Wound Repair Regen, 2007, 15: 54-60.

[8] Rachfal AW, Brigstock DR. Connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) in hepatic fibrosis [J]. Hepatol Res, 2003, 26:1-9.

[9] Kim JK. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp to assess insulin sensitivityinvivo[J]. Methods Mol Biol, 2009, 560: 221-238.

[10] Tolman KG, Fonseca V, Tan MH,etal. Narrative review: hepatobiliary disease in type 2 diabetes mellitus [J]. Ann Intern Med, 2004, 141: 946-956.

[11] Paradis V, Perlemuter G, Bonvoust F,etal. High glucose and hyperinsulinemia stimulate connective tissue growth factor expression: A potential mechanism involved in progression to fibrosis in nonalcoholic steatohepatitis [J]. Hepatology, 2001, 34: 738-744.

[12] Wang X, Li H, Fan Z,etal. Effect of zinc supplementation on type 2 diabetes parameters and liver metallothionein expressions in Wistar rats [J]. J Physiol Biochem, 2012, 68: 563-572.

[13] Qiang G, Zhang L, Yang X,etal. Effect of valsartan on the pathological progression of hepatic fibrosis in rats with type 2 diabetes [J]. Eur J Pharmacol, 2012, 685:156-164.

[14] Fukushima M, Nakamuta M, Kohjima M,etal. Fasudil hydrochloride hydrate, a Rho-kinase (ROCK) inhibitor, suppresses collagen production and enhances collagenase activity in hepatic stellate cells [J]. Liver Int, 2005, 25: 829-838.

[15] Hahn A, Heusinger-Ribeiro J, Lanz T,etal. Induction of connective tissue growth factor by activation of heptahelical receptors. Modulation by Rho proteins and the actin cytoskeleton [J]. J Biol Chem, 2000, 275: 37429-37435.

[16] Ikeda H, Kume Y, Tejima K,etal. Rho-kinase inhibitor prevents hepatocyte damage in acute liver injury induced by carbon tetrachloride in rats [J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2007, 293: 911-917.

[17] Laschke MW, Dold S, Jeppsson B,etal. Rho-kinase inhibitor attenuates cholestasis-induced CXC chemokine formation, leukocyte recruitment and hepatocellular damage in the liver [J]. J Sur Res, 2010, 159: 666-673.

[18] Zhou H, Li YJ. Rho kinase inhibitors: potential treatments for diabetes and diabetic complications [J]. Curr Pharm Des, 2012, 18, 2964-2973.

The roles of RhoA/Rho kinase in hepatic fibrosis of rats with type 2 diabetes

FANG Cai-xia1, ZHOU Hong1*, LI Gui-zhi1, WANG De-feng2, WANG Mian1

(1.Dept. of Endocrinology, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000;2.Dept. of Endocrinology, Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering, Handan 056002, China)

ObjectiveTo determine whether RhoA/Rho-kinase is involved in the pathogenesis of hepatic fibrosis in rats with type 2 diabetes.MethodsAn animal model of type 2 diabetes was developed by high fat diet combined with intraperitoneal injection of low-dose streptozotocin (STZ, 30 mg/kg, i.p.). At week 24, fasting blood glucose, triglycerides, cholesterol, aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase were measured. The deposition of collagen in liver was evaluated by Masson staining and the hydroxyproline determination. The mRNA expressions of transforming growth factor (TGF-β1) and connective tissue growth factor (CTGF) in liver tissue were assessed by RT-PCR. Immunohistochemistry staining for TGF-β1 was performed. The phosphorylation of myosin phosphatase target subunit 1(p-MYPT1) was measured by Western blot analysis.ResultsCompared with control rats, blood glucose, blood fat, aminotransferase and the deposition of collagen in the liver in the untreated diabetic rats were significantly increased (Plt;0.01); p-MYPT1 and TGF-β1 protein, the mRNA expression of TGF-β1 and CTGF was significantly enhanced (Plt;0.01). Compared with untreated diabetic rats, treatment with fasudil signi-ficantly decreased aminotransferase, deposition of collagen, p-MYPT1, mRNA expression of TGF-β1 and CTGF(Plt;0.01).ConclusionsHyperglycemia can activate the RhoA/Rho-kinase which maybe regulates TGF-β1/CTGF expression in liver tissues. RhoA/Rho-kinase plays an importent role in the development of diabetic liver fibrosis.

diabetic liver fibrosis；Rho-kinase; transforming growth factor beta 1; connective tissue growth factor; fasudil

2013-06-05

2013-10-09

河北省衛生廳重大課題(20090007)

*通信作者(correspondingauthor)： zhoubs2013@163.com

1001-6325(2014)03-0332-07

研究論文

R 364.3

A