沉默PARG基因增強局部對結腸癌的免疫應答

王潔瓊，李 戈

(瀘州醫學院 附屬醫院 1.細胞學教研室；2.泌尿外科，四川 瀘州 646000)

沉默PARG基因增強局部對結腸癌的免疫應答

王潔瓊1，李 戈2*

(瀘州醫學院 附屬醫院 1.細胞學教研室；2.泌尿外科，四川 瀘州 646000)

目的探討沉默結腸癌PARG基因后對腫瘤局部免疫狀態的影響。方法以PARG-shRNA慢病毒載體轉染CT26細胞為實驗組，未轉染CT26細胞和空載體轉染CT26細胞為對照組，分別將各組細胞在BALB/C小鼠脾包膜下接種形成肝轉移模型；Western blot法檢測脾臟移植瘤中PARG蛋白的表達；免疫熒光雙標法檢測脾臟中B220+DEC205+DC和CD11c+CD11b+DC，用激光共聚焦顯微鏡觀察上述細胞；免疫熒光單標記法檢測脾臟中CD4+T細胞及CD8+T細胞，用激光共聚焦顯微鏡觀察上述細胞；ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-10和IL-12的表達。結果PARG基因沉默后，脾臟移植瘤中PARG蛋白的表達量明顯較對照組降低(Plt;0.05)；脾臟組織中B220+DEC205+DC較對照組顯著減少；而CD11c+CD11b+DC較對照組明顯增多(Plt;0.05)；脾臟組織中的CD4+T細胞及CD4+/CD8+比值較對照組明顯升高(Plt;0.05)；血清中IL-10的表達較對照組明顯減少而IL-12的表達較對照組顯著增多(Plt;0.05)。結論沉默結腸癌PARG基因可通過影響DC及T細胞的增殖分化，增強腫瘤局部的免疫反應。

PARG；細胞因子；免疫機能；大腸癌

腫瘤的發生發展是一個多基因改變的過程，同時，機體的免疫狀態也與腫瘤的發生發展有著密切的關系。聚腺苷二磷酸核糖核苷水解酶(poly-ADP-ribose glycohydrolase, PARG)與炎性反應、缺血再灌注損傷、腫瘤等的發生發展都有著密切的關系。研究表明，在結腸癌中沉默PARG基因，可通過抑制腫瘤細胞的增殖、黏附、血管生成等抑制腫瘤的肝轉移[1]。那么，在結腸癌中抑制PARG基因能否通過改變機體的免疫狀態，從而進一步影響腫瘤的發展？基于此，本實驗通過檢測結腸癌PARG基因沉默后，脾臟組織中DC及T細胞的變化，探討免疫狀態的改變在結腸癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物與主要試劑

SPF級BALB/C小鼠，雌性，6～8周齡，體質量18～20 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供(合格證號SCXK,渝20020001)。抗PARG抗體和抗DEC205抗體(Abcam公司)。抗CD11b抗體(Santa Cruz公司)。抗B220抗體、抗CD11c抗體、抗CD4抗體和抗CD8抗體(Bioss 公司)。IL-10和IL-12 ELISA試劑盒(BD公司)。

1.2 常規培養細胞

小鼠結腸癌 CT26細胞系(四川大學華西醫院魏于全教授惠贈)。將PARG-shRNA慢病毒載體及慢病毒空載體(Sigma公司)轉染結腸癌CT26細胞，并篩選獲得穩定的轉染慢病毒PARG-shRNA載體和空載體的CT26細胞系。各組CT26細胞常規培養備用。

1.3 組織的獲取

分別在各組小鼠脾包膜下接種相應的CT26細胞建立肝轉移動物模型，14 d后處死各組小鼠，取脾臟組織，液氮保存備用；同時取各組小鼠眼眶血，低溫離心取上清，-80 ℃保存備用。

1.4 Western blot檢測PARG蛋白的表達

將液氮中各組小鼠的脾臟腫瘤組織裂解、勻漿，并按蛋白提取試劑盒說明提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白經電泳后轉移至PVDF膜上，抗PARG抗體(一抗)4 ℃過夜，相應的IgG(二抗)室溫孵育2 h，ECL試劑盒化學發光顯影。采用Bio-Rad凝膠成像儀拍攝圖像, Quantity One軟件進行相對定量分析。

1.5免疫熒光雙標法檢測B220+DEC205+DC及CD11c+CD11b+DC

將液氮中各組小鼠的脾臟組織進行連續冰凍切片，丙酮固定5 min，BSA 37 ℃孵育30 min，生物素標記抗小鼠DEC205單克隆抗體(1∶50，PBS稀釋)和抗小鼠B220多克隆抗體(1∶100，PBS稀釋)、抗小鼠CD11c和CD11b多克隆抗體(1∶50，PBS稀釋)混合作為一抗，4 ℃孵育過夜，相應的PE 標記的抗生物素(streptavidin)(1∶50，PBS稀釋)和FITC 標記的山羊抗兔IgG(1∶100，PBS稀釋)、FITC 標記的小鼠抗兔IgG(1∶50，PBS稀釋)和CY3標記的驢抗山羊IgG(1∶50，PBS稀釋)混合作為二抗，避光于37 ℃孵育1 h，陰性對照組中以PBS代替一抗，常規封片后激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。

1.6免疫熒光單標法檢測CD4+T細胞及CD8+T細胞

將液氮中各組小鼠的脾臟組織進行連續冰凍切片，丙酮固定5 min，BSA 37 ℃孵育30 min，抗小鼠CD4及CD8多克隆抗體(1∶50，PBS稀釋)分別作為一抗，4 ℃孵育過夜，FITC 標記的山羊抗兔IgG(1∶50，PBS稀釋)作為二抗，分別避光于37 ℃孵育1 h，常規封片后激光共聚焦顯微鏡觀察并照相，陰性對照組中以PBS代替一抗。

1.7ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-10及IL-12的表達

按照ELISA法試劑盒說明書中的操作步驟，將保存于-80 ℃各組小鼠的血清分別進行檢測，以觀察各組小鼠血清中IL-10和IL-12的變化。測量A=450 nm(15 min內)，繪制出標準曲線，并計算直線回歸方程，最后根據樣品的A值計算出相應樣品的實際濃度(10-9g/L)。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1PARG-shRNA慢病毒載體轉染CT26細胞接種小鼠后脾臟移植瘤PARG的變化

PARG-shRNA慢病毒載體轉染CT26細胞接種的小鼠脾臟移植瘤中，PARG蛋白的表達明顯低于對照組(Plt;0.05) (圖1，表1)。

2.2脾臟中B220+DEC205+DC數量的變化

PARG基因沉默組小鼠脾臟中B220+DEC205+DC的數量較對照組明顯降低(Plt;0.05)(圖2，表2)。

2.3脾臟中CD11c+CD11b+DC數量的變化

PARG基因沉默組小鼠脾臟中CD11c+CD11b+DC的數量較對照組顯著增多(Plt;0.05)(圖3，表2)。

1.untransfected group; 2.empty vector control group; 3.PARG-silenced group圖1 各組小鼠脾臟移植瘤PARG蛋白表達Fig 1 Expression of PARG protein in spleen transplant carcinoma in different groups

表1 各組小鼠脾臟移植瘤中PARG蛋白的表達Table 1 The expression of PARG protein in spleen trans- plant tumor of various groups (±s,n=6)

*Plt;0.05 compared with untransfected or empty vector control group.

A.untransfected group; B. empty vector control group; C. PARG-silenced group;1.DEC205+DC(PE); 2.B220+DC(FITC); 3.B220+DEC205+DC(PE,FITC)

圖2各組小鼠脾臟中B220+DEC205+DC的表達
Fig2TheexpressionofB220+DEC205+DCinspleenindifferentgroups(×40)

A.untransfected group; B.empty vector control group; C.PARG-silenced group;1.CD11b+DC(CY3); 2.CD11c+DC(FITC); 3.CD11c+CD11b+DC(CY3,FITC)

圖3 各組小鼠脾臟中CD11c+CD11b+DC的表達Fig 3 The expression of CD11c+CD11b+DC in spleen in different groups(×40)

*Plt;0.05 compared with untransfected or empty vector control group.

2.4脾臟中CD4+/CD8+T淋巴細胞比值的變化

在PARG基因沉默組中CD4+/CD8+的值明顯較對照組增大(Plt;0.05)(圖4，表3)。

表3 各組小鼠脾臟中CD4+/CD8+T淋巴細胞比值Table 3 The ratio of CD4/CD8 in spleen for various

*Plt;0.05 compared with untransfected or empty vector control group.

2.5PARG基因沉默對小鼠血清中IL-10及IL-12表達的影響

PARG基因沉默組中，IL-10的含量較未轉染組和空載體組明顯降低，差異具有統計學意義(Plt;0.05)；而PARG基因沉默組中IL-12的含量明顯較未轉染組和空載體組增多(Plt;0.05)(表4)。

A.CD4+T(FITC); B.CD8+T(FITC); 1.untransfected group; 2.empty vector control group; 3.PARG-silenced group圖4 脾臟中CD4+T淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞Fig 4 CD4+T cell and CD8+T cell in spleen of various groups(×40)

表4 各組小鼠血清中IL-10和IL-12的含量Table 4 The content of IL-10 and IL-12 in serum of various mice groups(±s,n=6)

*Plt;0.05 compared with untransfected or empty vector control group.

3 討論

機體的免疫功能與腫瘤的發生、發展密切相關，細胞免疫作為腫瘤免疫的核心，T淋巴細胞在其中發揮著重要作用。CD4+T細胞與CD8+T細胞比例的穩態維持著機體正常的免疫應答。當其比值下降時，患者的免疫機能降低，導致腫瘤增殖[2]。有文獻報道，大腸癌患者的CD4+T細胞比例顯著減低，同時，CD4+/CD8+比值也明顯降低；且隨著TNM分期的增加，CD4+T細胞比例及CD4+/CD8+比值逐漸減少[3]。

樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是目前已知功能最強大的抗原呈遞細胞，主要包括髓樣DC和漿樣DC，其中髓樣DC表型為CD11b+, CD11c+，促進CD4+T細胞向Th1分化；而漿樣DC則主要表現為B220+，CD19-，促進CD4+T細胞向Th2或Tr分化[4-5]。文獻報道，CD11c+CD11b+髓樣細胞能夠通過促進腫瘤細胞的凋亡發揮抗腫瘤作用[6]；B220+DEC205+DC可通過調節淋巴細胞的增殖分化在肝臟移植免疫耐受中發揮作用[7]。也有報道稱[8]，小鼠肝臟中誘導出的B220+/DEC205+DC對大腸癌肝轉移有促進作用。

IL-10作為重要的免疫調節和抗炎因子，不僅能調節DCs的分化和增殖，同時也能直接影響T細胞的功能[9]。IL-10最初被認為是誘導Th2反應的特異性細胞因子。后來證實，IL-10也與Tr反應密切相關[10]。而IL-12作為重要的抗癌因子，在腺瘤中的含量明顯高于其在結腸癌中的含量，且IL-12能夠抑制小鼠結腸癌的肝轉移[11]。

PARG 是主要的PAR水解酶。研究表明，在人大腸癌lovo細胞中敲除PARG基因，可降低大腸癌lovo細胞的基質黏附、運動及侵襲能力，抑制lovo細胞的增殖及分化能力[12]。在小鼠結腸癌模型中沉默PARG基因，可通過抑制腫瘤細胞的增殖、黏附、血管生成等抑制腫瘤的肝轉移[1]。那么，沉默PARG基因后，腫瘤局部的免疫狀態是否改變及發生了何種改變呢？

本研究表明，在PARG基因沉默后，耐受性的B220+DEC205+DC顯著減少而反應性的CD11c+CD11b+DC明顯增多，且CD4+T細胞及CD4+/CD8+比值明顯升高；血清中免疫抑制性因子IL-10的表達明顯減少而抗腫瘤因子IL-12的表達顯著增多。綜上所述，在結腸癌中沉默PARG基因后，可引起腫瘤局部免疫狀態的改變，促進Th1反應的增強，Th2及Tr反應的減弱，從而增強局部的免疫能力，進而抑制腫瘤的侵襲轉移，其具體詳盡機制有待進一步研究。

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SilencingPARGenhances local immune response to colon carcinoma

WANG Jie-qiong1, LI Ge2*

(1.Dept. of Cytology; 2.Dept. of Urologic Surgery, Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of silencingPARGon local immune status in colon carcinoma.MethodsLentivirus PARG-shRNA(Short hairpin RNA) was transfected into CT26 cells as experiment group, the CT26 cells without any treatment or treated with Lentivirus empty vector served as control group. Animal models for liver metastases of colon carcinoma were established by splenic subcapsular inoculation of each group of CT26 cells in Balb/c mice. The expression of PARG protein in spleen transplant tumor was detected by Western blot analysis. Immunofluorescence double labeling assay was used for the numbers detection both of B220+DEC205+DC and CD11c+CD11b+DC in the spleen. CD4+T cells and CD8+T cells in the spleen were tested by immunofluorescence single staining. All of these cells were observed by confocal laser scanning microscope. The levels of IL-10 and IL-12 in serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsThe expression of PARG in spleen transplant tumor was reduced in PARG-silenced group compared to that in control groups(Plt;0.05). In PARG-silenced group, the amounts of B220+DEC205+DC were less and the numbers of CD11c+CD11b+DC were more in spleen than that in control groups(Plt;0.05). The numbers of CD4+T cells and the ratio of CD4+/ CD8+in spleen of PARG-silenced group were increased compared to that in control groups(Plt;0.05). The serum levels of IL-10 were lower but the serum content of IL-12 were higher in PARG-silenced group than that in control groups(Plt;0.05).ConclusionsSilencingPARGcould strengthen the local immune response to colon cancer by effect on the proliferation and differentiation of DC and T cells.

PARG; cytokine; immune function; colon carcinoma

2013-08-14

2013-11-21

*通信作者(correspondingauthor)： wangjq1048@sina.com

1001-6325(2014)03-0391-06

研究論文

R735.3+4

A