RNR3調(diào)控重組Lac Z基因酵母細(xì)胞對化學(xué)誘變原的篩選

葛宜枝，王瑞鯤，王 磊，謝云斌，劉星妍，李湘鳴

(揚(yáng)州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室， 江蘇 揚(yáng)州 223900)

研究論文

RNR3調(diào)控重組LacZ基因酵母細(xì)胞對化學(xué)誘變原的篩選

葛宜枝，王瑞鯤，王 磊，謝云斌，劉星妍，李湘鳴*

(揚(yáng)州大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室， 江蘇 揚(yáng)州 223900)

目的建立化學(xué)致突變物的體外快速篩選方法。方法用PCR法從酵母基因組中擴(kuò)增RNR3啟動子，將其插入到pMP206/ERE報(bào)告載體，將該載體轉(zhuǎn)入W303-1A酵母細(xì)胞。當(dāng)化學(xué)誘變原作用于酵母細(xì)胞時，會誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶表達(dá)，可對具有DNA毒性的化學(xué)物進(jìn)行篩選。結(jié)果許多可造成DNA損傷的化學(xué)誘變原可誘導(dǎo)RNR3的表達(dá)。使DNA發(fā)生烷基化的誘變原(甲磺酸甲脂和瘤可寧)、使DNA發(fā)生斷裂的誘變原(順鉑、4-硝基-N-氧化喹啉、博來霉素和福來霉素)、抑制DNA合成酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶的誘變原(5-氟尿嘧啶、羥基脲和喜樹堿)均可誘導(dǎo)RNR3的表達(dá)。結(jié)論RNR3調(diào)控的重組Lac Z報(bào)告基因酵母可用于對許多化學(xué)誘變原的篩選，篩選過程可在96孔板中進(jìn)行，因而具有高通量性。

誘變原；酵母；RNR3基因；β-半乳糖苷酶

化學(xué)誘變原引起的基因的突變，可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制之一。建立一種快速的篩選化學(xué)誘變原的方法是預(yù)防和治療腫瘤的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的致突變檢測方法Ames出現(xiàn)假陽性或是假陰性的機(jī)率較高[1]，且是針對原核生物，無法進(jìn)行快速、高通量的化合物的檢測。核糖核苷酸還原酶(Ribonucleotide reductase, RNR)是合成脫氧核糖核苷三磷酸的限速酶，正常生長條件下，細(xì)胞中幾乎檢測不到RNR3的表達(dá)，當(dāng)DNA損傷或是合成阻斷時可誘導(dǎo)大量RNR3表達(dá)[2-3]。許多化學(xué)誘變原，與DNA 結(jié)合形成DNA 加合物，導(dǎo)致基因的重排、斷裂或激活原癌基因，誘發(fā)細(xì)胞的癌變。酵母具有生長快、生長條件與原核相似、蛋白的翻釋加工與哺乳動物細(xì)胞相似等特點(diǎn)，因此是較為理想的宿主細(xì)胞?？捎梅肿由飳W(xué)方法構(gòu)建RNR3調(diào)控的酵母報(bào)告載體，轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞。當(dāng)化學(xué)誘變原作用于重組酵母細(xì)胞時，會通過RNR3誘導(dǎo)LacZ基因的表達(dá)，通過測β-半乳糖苷酶的表達(dá)量，篩選具有DNA毒性的化學(xué)物。

1 材料與方法

1.1RNR3調(diào)控的重組LacZ基因酵母細(xì)胞的建立

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)提取酵母基因組[4]，根據(jù)GenBanK的DNA序列，用PCR方法擴(kuò)增RNR3啟動子，將其插入到pMP206/ERE酵母報(bào)告載體，從而構(gòu)建成RNR3調(diào)控的Lac Z酵母報(bào)告載體，命名為pRNR3-Lac Z。用醋酸鋰方法轉(zhuǎn)化于酵母細(xì)胞W303-1A(基因型為Matα,ade2-1,his3-11,leu2-3,trp1-1,ura3-1)，用SD/-ura培養(yǎng)板篩選陽性克隆，將此酵母細(xì)胞命名為W303-1A/RNR3-LacZ。

1.2 實(shí)驗(yàn)研究

1.2.1 時間劑量效應(yīng)：用甲磺酸甲脂(methyl methanesulfonate,MMS，Sigma公司)檢測重組酵母細(xì)胞的時間劑量效應(yīng)。從SD/-ura平板挑取酵母克隆，接種于SD/-ura培養(yǎng)液中，30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。取10 mL消毒玻璃瓶，加入SD/-ura培養(yǎng)液1.5 mL及振蕩培養(yǎng)的酵母培養(yǎng)液0.5 mL，加入用乙醇配制的MMS 10 μL，其濃度見表1，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，于不同時間測β半乳糖苷酶的活性[5]，每個劑量組做3個復(fù)孔，結(jié)果用誘導(dǎo)倍數(shù)表示。

1.2.2 劑量效應(yīng):根據(jù)MMS的時間劑量效應(yīng)關(guān)系，用不同DNA作用水平的化學(xué)誘變原(Sigma公司)對重組酵母細(xì)胞作用12 h，進(jìn)行劑量效應(yīng)研究。

1)與DNA發(fā)生結(jié)合的誘變原：①放線菌素D(Actinomycin D):用雙蒸水配制，濃度為2×10-1、1×10-1、5×10-2、2.5×10-2、1.25×10-1、6.3×10-3和3.1×10-3和0 mg/L。②溴乙錠 (ethidium bromide，EB)：用雙蒸水配制，濃度為25、12.5、6.3、3.1、0.8、0.2、0.05和0 μg/L。

2)使DNA發(fā)生烷基化的誘變原:①絲裂霉素C(mitomycin C)：用0.9%氯化鈉注射液配制，濃度為5、2.5、1.25、0.625、0.31、0.16、0.08和0 mg/L。②甲磺酸甲脂(MMS)：見時間劑量效應(yīng)。②瘤可寧(chlorambucil，苯丁酸氮芥)：用乙醇配制，終濃度為50、25、12.5、6.25、3.1、1.6、0.8和0 mg/L。

3)使DNA發(fā)生斷裂的誘變原：①順鉑(cis-Platinum)：用雙蒸水配制，終濃度為25、12.5、6.25、3.1、1.6、0.8、0.4和0 mg/L。②4-硝基-N-氧化喹啉(4-nitroquinoline-N-oxide,4-NQO)：用DMSO配制，終濃度為5、2.5、1.25、0.625、0.31、0.16、0.08和0 mg/L。③博來霉素(bleomycin)：用0.9%氯化鈉注射液配制，終濃度為12.5、6.25、3.1、1.6、0.8、0.4、0.2和0 mg/L。④福來霉素(phleomycin)：用雙蒸水配制，終濃度為25、12.5、6.25、3.1、1.6、0.8、0.4和0 mg/L。

4)抑制DNA合成酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶的誘變原: ①5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)：用0.9%氯化鈉注射液配制，終濃度為2.5×10-1、1.25×10-1、6.2×10-2.、3.1×10-2、1.5×10-2、8×10-3、4×10-3和0 mg/L。②羥基脲(hydroxyurea)：用無菌雙蒸水配制，終濃度為912、456、228、114、57、28.5、14.2和0 mg/L。④喜樹堿(camptothecin)：用1 mol/L NaOH配制，終濃度為15、7.5、3.75、1.9、0.9、0.5、0.1和0 mg /L。③阿非迪霉素(aphidicolin)：用乙醇配制，終濃度為2.5、1.25、0.625、0.312、0.155、0.08、0.040和0 mg/L。

5)其他生物化學(xué)作用:①秋水仙堿(colchicine)：用0.9%氯化鈉注射液配制，終濃度為2.5×10-1、1.25×10-1、6.25×10-2、3.1×10-2、1.6×10-2、8×10-3、4×10-3和0 mg/L。

6) 非基因毒性化合物:①刀豆氨酸(canavanine)：用0.9%氯化鈉注射液配制，終濃度為50、25、12.5、6.25、3.1、1.6、0.8和0 mg/L。②四環(huán)素(tetracycline)：用0.9%氯化鈉注射液配制，終濃度為400、200、100、50 000、25、12.5、6.25和0 mg/L。

取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，依次加入不同溶劑配制的不同濃度1 μL、150 μL SD/-ura培養(yǎng)液和50 μL、30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜的W303-1A/RNR3-Lac Z培養(yǎng)液，繼續(xù)30 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，測β-半乳糖苷酶的活性。選用各自化學(xué)物的溶劑1 μL作為空白對照(0)，余操作同實(shí)驗(yàn)組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在進(jìn)行各受試物劑量效應(yīng)分析時，為消除時間、細(xì)胞數(shù)量不同對酶活性的影響，用實(shí)驗(yàn)組與空白對照組所誘導(dǎo)的酶活性之比即誘導(dǎo)倍數(shù)，進(jìn)行劑量效應(yīng)分析。判斷標(biāo)準(zhǔn)：受試組誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活性為對照組的1.5倍以上時，并具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系時，可判斷為陽性。用Excel統(tǒng)計(jì)軟件分別進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)制圖分析。

2 結(jié)果

2.1 時間劑量效應(yīng)

重組酵母細(xì)胞經(jīng)不同濃度的MMS作用4 h時，開始出現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系；作用8 h時，β-半乳糖苷酶表達(dá)量呈線性升高；當(dāng)作用12 h時達(dá)高峰，在200 m/L時，β-半乳糖苷酶活性為對照的32倍；當(dāng)作用的16 h時，雖然在受試濃度范內(nèi)，所產(chǎn)生誘導(dǎo)倍數(shù)均大于2，但多數(shù)低于12 h，而且劑量效應(yīng)曲線呈現(xiàn)先升后下降的變化，高峰位于25 mg/L，在100 mg/L以上組，誘導(dǎo)倍數(shù)甚至低于4 h組(表1)。

2.2 劑量效應(yīng)

放線菌素D和溴乙錠(EB)是屬于與DNA發(fā)生結(jié)合的誘變原。見放線菌素D和EB未對β-半乳糖苷酶產(chǎn)生明顯的誘導(dǎo)作用。MMS、絲裂霉素C和瘤可寧同屬為DNA烷基化化合物，作用12 h后發(fā)現(xiàn)MMS對細(xì)胞的β-半乳糖苷酶誘導(dǎo)最強(qiáng)(見時間劑量效應(yīng)部分)，其次是瘤可寧，而絲裂霉素C在受試濃度范圍內(nèi)，與細(xì)胞無明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(圖1)。

在DNA斷裂誘變原中，順鉑與W303-1A/RNR3-Lac Z存在劑量效關(guān)，當(dāng)濃度為25 mg/L時，酶活性為對照組的5倍；博來霉素和福來霉素亦對酶的活性產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，后者誘導(dǎo)倍數(shù)較高；4-NQO在0.625 mg /L 對β-半乳糖苷酶有一誘導(dǎo)峰(圖2)。

表1 MMS于不同時間對W303-1A/RNR3-Lac Zβ-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)

圖1 與DNA發(fā)生結(jié)合的誘變原和烷基化的誘變原與W303-1A/RNR3-Lac Z的劑量效應(yīng)關(guān)系Fig 1 Effect of DNA intercalation agents and DNA alky-lation compounds on fluorescent density from W303-1A/RNR3-Lac Z

圖2 使DNA發(fā)生烷基化的誘變原與W303-1A/RNR3-Lac Z的劑量效應(yīng)關(guān)系Fig 2 Effect of DNA cleavage mutagens on fluorescent density from W303-1A/pRNR3-Lac Z

在抑制DNA合成酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶的誘變原中，除阿非迪霉素外，5-氟尿嘧啶(5-FU)、羥基脲和喜樹堿與重組細(xì)胞有劑量效應(yīng)關(guān)系(圖3)。

圖3 抑制DNA合成酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶的誘變原與W303-1A/RNR3-Lac Z的劑量效應(yīng)關(guān)系Fig 3 Effect of inhibitors of DNA polymerases or topoisomerase on fluorescent density from W303-1A/RNR3-Lac Z

秋水仙堿、刀豆氨酸和四環(huán)素在受試濃度范圍內(nèi)，與W303-1A/RNR3-LacZ的β-半乳糖苷酶無明顯劑量效應(yīng)關(guān)系(圖4)。

圖4 非DNA毒性化合物與W303-1A/RNR3-Lac Z的劑量效應(yīng)關(guān)系Fig 4 Effect of other Chemical mutagens on fluorescent density from W303-1A/RNR3-Lac Z

3 討論

從時間劑量效應(yīng)關(guān)系來看，RNR3調(diào)控的重組Lac Z基因酵母細(xì)胞，經(jīng)不同濃度的MMS誘導(dǎo)后，表達(dá)量在8～12 h達(dá)高峰，以后開始下降，說明細(xì)胞的DNA修復(fù)能力在不斷加強(qiáng)，以抵抗誘變原的損傷，同時細(xì)胞啟動多種代謝途徑，誘變原在各種生物化學(xué)因素的作用下逐步失去活性。考慮到不同誘變原對DNA的損傷能力和細(xì)胞的毒性不同，在對不同誘變原進(jìn)行劑量效應(yīng)研究時，將其時間作用設(shè)定為12 h，這與文獻(xiàn)報(bào)道[6]出現(xiàn)較大的差異，原因主要是研究者目的以及所用的報(bào)告基因不同。

DNA毒性化合物通過不同的水平損傷DNA。RNR3對直接損傷或阻斷DNA復(fù)制的誘變原較為敏感，而對與DNA發(fā)生結(jié)合的誘原變?nèi)绶啪€菌素D、溴乙錠等不敏感，由上述可見，放線菌素D、絲裂霉素C、EB和阿非迪霉素呈陰性結(jié)果，而MMS、瘤可寧、順鉑、4-NQO、博來霉素、福來霉素、5-FU、喜樹堿和羥基脲(hydroxyurea)呈陽性結(jié)果，可見該重組酵母細(xì)胞對多數(shù)化學(xué)誘變原呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，對使DNA發(fā)生斷裂的毒性化合物較敏感，這與文獻(xiàn)報(bào)道[6]相一致。

秋水仙素破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期；刀豆氨酸結(jié)構(gòu)與精氨酸相似，所形成蛋白質(zhì)的功能出現(xiàn)異常；四環(huán)素與核蛋白體的30S亞單位結(jié)合，抑制蛋白的合成。從對這3種的非基因毒性化合研究結(jié)果來看，W303-1A/RNR3-Lac Z與其無劑量效應(yīng)關(guān)系，說明該重組細(xì)胞有較好的特異性。

在研究中，重組酵母細(xì)胞β-半乳糖苷酶的表達(dá)，除與受試物的作用有關(guān)外，還會受到細(xì)胞的數(shù)量和“狀態(tài)”的影響，通常用細(xì)胞密度A600對β-半乳糖苷酶的活性進(jìn)行校正。由于A600反映是活細(xì)胞、“病細(xì)胞”和死細(xì)胞的總數(shù)，所以最好將A600控制在0.25～0.80之間[7]，才能很好地反映細(xì)胞的數(shù)量，否則會造成較大的誤差。

有毒化學(xué)物通過多種途徑作用于細(xì)胞，某些誘變原在一定的濃度時，會對細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性或?qū)Ζ?半乳糖苷酶產(chǎn)生抑制作用，如4-硝基-N-氧化喹啉(4-NQO)和瘤可寧等化學(xué)物，低濃度時可誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶的表達(dá)，而在高濃度時，由于對細(xì)胞的毒性增加，使得β-半乳糖苷酶的表達(dá)下降；溴乙錠在低濃度時，未誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶的表達(dá)，而在高濃度時，對該酶的表達(dá)產(chǎn)生明顯的抑制作用。

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Screen for chemical mutagens basedon the recombinant Lac Z gene yeast cells regulated by RNR3 promoter

GE Yi-zhi, WANG Rui-kun, WANG Lei, XIE Yun-bin, LIU Xing-yan, LI Xiang-ming*

(Dept. of Preventive Medicine, Medical College of Yangzhou University，Yangzhou 225001, China)

ObjectiveTo develop a fast screening method for chemical mutagens.MethodsRNR3 promoter was amplified using polymerase chain reaction (PCR) from yeast genome and inserted into the yeast report vector of pMP206 / ERE to construct yeastLacZgene report vector regulated byRNR3. This vector was transformed into the yeast cell of W303-1A. When the yeast cell was treated by the chemical mutagenesis, the expression ofLacZgene was induced. So it can be used to screen the chemicals with DNA toxicity by measuring the beta-galactose enzyme activity.ResultsVarious chemicals that cause DNA damaged can induceRNR3 expression. The mutagens alkylating DNA (methyl methanesulfonate and chlorambucil), the cleavages of DNA (cisplatin, 4-nitro-N-oxidation of quinoline, bleomycin and phleomycin) and the inhibitor of DNA polymerase or topoisomerase (5-fluorouracil, hydroxyurea and camptothecin) can induceRNR3 expression.ConclusionsRecombinantLacZreport gene yeast cells regulating byRNR3 can be used for the screening of chemical mutagen and this screen can be carried out in 96 well micro plate as a high throughput technology.

mutagens; yeast cells;RNR3 gene; β-galactosidase

2013-08-27

2013-10-28

*通信作者(correspondingauthor)：847264344@qq.com

1001-6325(2014)05-0679-05

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