神經病理性疼痛對大鼠脊髓背角蛋白磷酸酶1的表達調控作用

陳 思，申 樂，黃宇光

(中國醫學科學院 北京協和醫院 麻醉科， 北京 100730)

研究論文

神經病理性疼痛對大鼠脊髓背角蛋白磷酸酶1的表達調控作用

陳 思，申 樂，黃宇光*

(中國醫學科學院 北京協和醫院 麻醉科， 北京 100730)

目的明確雙側坐骨神經松結扎(bCCI)大鼠脊髓背角蛋白磷酸酶1催化亞基β異構體(PPP1CB)的表達水平及其與miR-203之間的關系，以及加巴噴丁的干預效果。方法48只雌性大鼠，被隨機分為Naive組、Sham組、bCCI組和bCCI+加巴噴丁組，建立bCCI模型。加巴噴丁干預組分別于術前15 min 1次、術后第7天起每日2次腹腔注射給予加巴噴丁100 mg/kg，連續7 d。術后第14天處死大鼠，留取脊髓背角(L4～L6)標本，分別利用real-time PCR與Western blot技術檢測PPP1CBmRNA及蛋白質表達，并進行生物信息學分析。結果PPP1CBmRNA表達顯著下降約80%，而大鼠脊髓背角PPP1CB蛋白表達水平則較對照組和假手術組上升約2倍；加巴噴丁干預組大鼠脊髓背角PPP1CB蛋白表達水平較未干預組顯著回落(P<0.05)，但未恢復到對照組和假手術組水平，而PPP1CBmRNA表達水平則較未干預組有顯著回升(P<0.05)，恢復到與正常對照組、假手術組相同水平；利用生物信息學驗證了miR-203對PPP1CB的調控關系。結論bCCI大鼠脊髓背角PPP1CB蛋白的表達量上升可能受到了miR-203的調控作用，并可能通過多種途徑參與了神經病理性疼痛的發生發展。

神經病理性疼痛；bCCI；蛋白磷酸酶1；miR-203；加巴噴丁

神經病理性疼痛是由于疾病或損傷累及體感神經系統而引起的慢性疼痛，給個人、家庭及社會造成了巨大的痛苦和負擔。本實驗的前期研究發現，雙側坐骨神經松結扎(bilateral chronic constriction injury, bCCI)大鼠術后第14天脊髓背角miR-203表達水平顯著降低[1]，而PPP1CB蛋白表達水平顯著升高[2]。

蛋白磷酸酶1催化亞基β異構體(protein phosphatese1, catalytic subunit, beta isozyme,PPP1CB)，是蛋白磷酸酶1(PP1)的催化亞基。PP1是真核細胞內重要的絲/蘇氨酸磷酸酶，進化上高度保守的蛋白質之一。PP1脫磷酸作用的發揮主要依賴于其催化亞基[3]，可參與調節多種重要的生理功能與細胞過程。近年來有研究顯示，PP1在年齡相關的記憶減退、遺忘加速、學習力下降等現象中發揮著重要的作用[4]。

與傳統單側坐骨神經松結扎(unilateral chronic constriction injury, uCCI)不同，本研究采用bCCI建立神經病理性疼痛大鼠模型，并利用加巴噴丁(gabapenting，GBP)進行治療，旨在探索miR-203與bCCI大鼠脊髓背角PPP1CB的表達調控關系以及加巴噴丁的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級健康Sprague-Dawley雌性大鼠，體質量180～200 g[中國醫學科學院北京協和醫院實驗動物中心，SYXK(京)2010-0028]，飼養于屏障環境，有良好的通風和空氣過濾系統，室溫22 ℃左右，相對濕度40%左右，明暗各12 h，自由攝水和食物，定時更換籠具和墊料。適應環境3～5 d。所有實驗方法均經過北京協和醫院實驗動物倫理委員會的審查確認。

1.1.2 實驗試劑：Trizol(Applied Biosystems公司，15596-018)；PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒和SYBR Premix ExTaqTMII試劑盒(Takara公司)； RIPA單去污劑蛋白裂解液(北京海誠遠宏科技有限公司)；BCA法蛋白含量測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；加巴噴丁(恩華藥業)GAPDH與PPP1CB的正向引物序列(上海生工生物工程公司合成)分別為5′-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3′和5′-TGGTGG TATGATGAGTGTGGA-3′；反向引物序列分別為5′-A TGCAGGGATGATGTTCTGG-3′和5′-CCTTTTCTTCG GTGGATTAGC-3′。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組：48只大鼠隨機分成4組(n=12)：bCCI組、sham組、Naive組和bCCI+加巴噴丁組。加巴噴丁干預組分別于術前15 min 100 mg/kg腹腔注射1次、術后第7天起100 mg/kg每日兩次腹腔注射加巴噴丁(原料藥)，連續7 d。

1.2.2 bCCI模型的建立：參照Bennet和Xie等[5]的方法，腹腔給藥戊巴比妥鈉(40～50 mg/kg)麻醉。側臥位，手術側在上，消毒，在股骨下方約1 cm平行于股骨切開皮膚,用小剝離子經股二頭肌間隙鈍性分離肌肉,暴露坐骨神經,用神經剝離子輕柔將坐骨神經與周圍軟組織分離；在坐骨神經分成3支前的主干部位游離神經7 mm左右,在距神經起始處上方2 mm用4.0含鉻羊腸線結扎坐骨神經4道，每道間隔約1 mm，使被結扎的神經長約4～5 mm。松緊度以打結時可見肌肉輕微抽動為準；局部0.9%氯化鈉注射液沖洗，間斷縫合肌肉筋膜、皮下組織以及皮膚；另一側采用相同手術方法。假手術組除僅暴露而不結扎坐骨神經外,其余同模型組。手術由同一人操作。

1.2.3 標本的制備：于疼痛行為學高峰期即模型術后第14天腹腔給藥2.5%戊巴比妥鈉40 mg/kg，深度麻醉后斷頭處死大鼠。俯臥位,迅速剪開背部皮膚, 沿棘突切開皮膚皮下組織,用咬骨鉗分別咬去椎板及椎弓根,暴露脊髓，小心取出腰膨大(L4～L6),以脊髓中央管為界，切除脊髓前角，取脊髓背角立即放入干冰中，待取材完畢盡快放入超低溫冰箱保存。

1.2.4 大鼠脊髓背角PPP1CBmRNA表達水平的測定：PPP1CBcDNA以GAPDH為內參，應用real-time PCR反應檢測儀行熒光實時定量PCR擴增,測定PPP1CB以及內參基因GAPDH的相對表達量，反應過程中監測各樣品孔的擴增曲線，各孔擴增反應均勻上升，加樣差異<0.5。計算mRNA的相對表達水平。

1.2.5 大鼠脊髓背角PPP1CB蛋白質水平的測定：取標本，提取總蛋白，BCA法進行蛋白含量測定。配置工作液，進行SDS-PAGE電泳，堆積膠80 V，分離膠120 V，總電泳時間2 h左右。以300 mA恒流轉膜90 min，加入封閉液室溫封閉1 h左右后進行免疫反應。用ImageQuant LAS 4000mini進行儀器曝光。將儀器預冷至-25 ℃，將A和B兩種試劑以等體積混合后滴于PVDF膜上，反應3 min后，用濾紙將PVDF膜表面液體吸干后置于托盤，放入儀器內，對焦清楚后進行化學發光。調整曝光時間，保存曝光圖像。利用ImageJ軟件分析系統，對Western blot曝光結果進行分析，并將吸光度值進行統計學分析。

1.2.6 miRNA靶基因預測：使用mirSVR和PhastCons兩種軟件計算得分，所用到的服務器地址如下： http://www.microrna.org/microrna/home.do/;http://compgen.bscb.cornell.edu/phast/phastCons-HOWTO.html/;計算結果若mirSVR score≤-0.1且PhastCons score>0.57，則視為結合位點有效。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1bCCI大鼠脊髓背角PPP1CBmRNA相對表達水平

PCR產物呈現特異單峰，無引物二聚體及其他非特異產物(圖1,2)。PPP1CB與GAPDHcDNA熒光實時定量PCR擴增結果(圖3)示bCCI組與sham組或Naive組均有顯著性差異(P<0.05)。

‘Temperature’ of the horizontal axis corresponds to the Tm value of the PCR product, while vertical axis means the speed of real-time fluorescence intensity; each peak of the curve indicates a PCR product圖1 PPP1CB熔解曲線Fig 1 Dissociation curve of PPP1CB

The horizontal axis represents the number of cycles in the PCR reaction, the vertical axis represents the real time fluorescence intensity of the cycles圖2 PPP1CB擴增曲線Fig 2 Amplification curve of PPP1CB

Using ANOVA, the results show significant difference between bCCI group and Naive, sham, bCCI + GBP group; no significant difference among the other groups; *P<0.05 compared with bCCI+GBP, Naive and sham group圖3 利用2-ΔΔCt法對PPP1CB基因表達差異的分析結果Fig 3 The differential gene expression analysis results by the use of 2-ΔΔCt method(±s, n=6)

2.2bCCI大鼠脊髓背角PPP1CB蛋白質相對表達水平

蛋白濃度標準曲線圖(圖4)，曝光結果(圖5)。吸光度值分析結果(圖6)：bCCI組PPP1CB表達量上調,與sham組、Naive組相比有顯著性差異(P<0.05)，約為此二組的2倍。加巴噴丁干預后，干預組表達量下降，雖未下降到基礎水平，但與sham組、Naive組和bCCI組比較均有顯著性差異(P

圖4 蛋白濃度測定標準曲線圖Fig 4 Standard curve of protein concentration measured

圖5 Western blot測PPP1CB蛋白表達水平的曝光結果Fig 5 Exposure results of Western blot measuring the expression level of PPP1CB protein

The sham group showes no significant difference compared to Naive group, while there are significant differences between other groups; *P<0.05 compared with Naive and sham group; #P<0.05 compared with bCCI group圖6 各組PPP1CB蛋白相對表達水平Fig 6 PPP1CB protein relative expression of

2.3 生物信息學結果(圖7)

There are three valid bonding sites between miR-203 and PPP1CB gene in rats, which mirSVR score ≤-0.1 and Phast Cones score> 0.57, considered valid圖7 驗證miR- 203與PPP1CB之間關系的生物信息學結果Fig 7 Bioinformatics results of the relationship between miR- 203 and PPP1CB

3 討論

蛋白磷酸化和去磷酸化是生物界最重要的調節機制[6]。在真核細胞的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶中，PP1和PP2A的作用占到了90%以上[7]。從分子結構上看，PP1由一個高度保守的催化亞基和幾十種不同的調節亞基組成的異二聚體全酶[8]，已經被證明參與糖原代謝、骨骼肌的收縮和舒張、細胞周期、DNA的復制、轉錄以及細胞凋亡等生理過程。

而PP1與疼痛的關系卻鮮有報道。有文獻指出，PP1參與了大鼠三叉神經抗河豚毒素(TTX-R)鈉通道的調控作用[9]。TTX-R鈉離子通道在人類DRG小直徑感覺神經元中表達，因其與疼痛感受C纖維神經元的密切聯系而被認為參與了疼痛感受途徑[10]。傳統研究認為，DRG神經元中蛋白激酶C、環腺苷酸單磷酸鹽依賴的蛋白激酶和蛋白激酶G介導的通路可以使電壓依賴的鈣離子通道發生改變[10- 11]，而根據本研究結果可以提出大膽假設，PP1也有可能在大鼠脊髓背角參與了鈣離子通道的調控，從而介導疼痛的發生發展。

此外，研究顯示PP1是一種具有抑制學習和記憶作用的分子[4]。當PP1基因受到抑制后，腦中CREB (cyclic AMP-dependent response element binding)蛋白、鈣調節蛋白依賴激酶II (CaMKII)、AMPA受體的GluR1亞單位等磷酸化增強，大鼠的學習、記憶效果更為理想。PP1抑制劑可以延長大鼠的記憶時間，說明PP1同樣能夠促進遺忘。另有文獻指出，PP1通過鈣調神經磷酸酶和降低突觸可塑性來影響學習，促進遺忘[12]。就本研究來說，PP1CB在大鼠中樞神經系統的蛋白表達量升高也許是由于疼痛造成的自我保護機制，促進大鼠對于疼痛等不適感覺的遺忘。

在miR-203對PPP1CB的調控方面，根據本研究結果以及本實驗前期的研究結果[1- 2]推斷，可能是miR-203本身對PPP1CB起到負向調控作用，因此bCCI大鼠脊髓背角miR-203的減少反而導致了PPP1CB蛋白表達量的上升。

目前，關于加巴噴丁治療神經病理性疼痛具體的作用機制仍眾說紛紜，主流思想認為，加巴噴丁作用于神經元表達的α2δ1鈣離子通道亞基，從而調節GABA的活性[13]，去甲腎上腺素激活的類膽堿通路被激活也參與了加巴噴丁的鎮痛作用[14]。另有研究表明，加巴噴丁可增加杏仁核內源性阿片肽物質的釋放，預先給藥可減少阿片類藥物的需求量[15]。本研究在加巴噴丁給藥后，大鼠脊髓背角PPP1CB的蛋白表達雖有顯著恢復，卻未下降到與對照組、假手術組同樣水平，推測可能由于參與的機制復雜多樣，以及建立CCI模型時由鉻制腸線性質決定的炎性疼痛參與其中，導致加巴噴丁并不能完全發揮作用。

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Neuropathic pain regulates proteinphosphatase 1 expression in rat spinal cord dorsal horn

CHEN Si, SHEN Le, HUANG Yu-guang*

(Dept. of Anesthesiology，PUMC Hospital，CAMS, Beijing 100730, China)

ObjectiveTo clarify the PPP1CB expression level in spinal cord dorsal horn of bCCI rats and its relationship with miR-203, as well as the intervention effect of gabapentin.MethodsForty-eight female rats were randomly divided into 4 groups(Naive，sham，bCCI，bCCI+gabapentin). The interfered group rats were injected 100 mg/kg gabapentin 15 min before, 7 days after operation for 7 consecutive days, bid, ip. All rats were sacrificed at POD14. Spinal dorsal horn(L4-L6) were assayed for real-time PCR, Western blot to detect mRNA and protein level change and bioinformatics analysis was also involved.ResultsThe PPP1CB protein expression level of spinal cord dorsal horn (L4-L6) significantly increased approximately 2-fold compared with control and sham group, whilePPP1CBmRNA expression level was significantly decreased by about 0.8 times. After gabapentin intervention, PPP1CB protein level was changed whilePPP1CBmRNA expression was back to normal compared to bCCI group. Meanwhile, bioinformatics tools verified PPP1CB is one of the target genes of miR-203.ConclusionsThe increase expression of PPP1CB protein in the spinal dorsal horn may play a role in the mechanism of neuropathic pain, and might be regulated by miR-203.

neuropathic pain；bilateral chronic constriction injury(bCCI)；protein phosphatase 1；miR-203；gabapentin

2013- 10- 08

2014- 01- 17

國家自然科學基金(31070930，81200869)

*通信作者(correspondingauthor)： garybeijing@163.com

1001-6325(2014)08-1027-05

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