GDF-5聯合地塞米松誘導大鼠BMSCs向類髓核樣細胞分化

魏強強，殷嫦嫦，殷 明，何丁文，周榮平，梁廣勝,3

(1.九江學院 轉化醫學重點實驗室， 江西 九江 332000； 2.南昌大學 第二附屬醫院 骨一科；3.南昌大學 研究生院 醫學部，江西 南昌 330006)

研究論文

GDF-5聯合地塞米松誘導大鼠BMSCs向類髓核樣細胞分化

魏強強1,2,3，殷嫦嫦1*，殷 明2，何丁文2，周榮平2，梁廣勝2,3

(1.九江學院 轉化醫學重點實驗室， 江西 九江 332000； 2.南昌大學 第二附屬醫院 骨一科；3.南昌大學 研究生院 醫學部，江西 南昌 330006)

目的探討 GDF-5聯合地塞米松誘導大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)向類髓核樣細胞分化潛能及其表型的改變。方法用全骨髓貼壁法及序貫酶消化法分別分離培養大鼠BMSCs和髓核細胞(NPCs),均取P3代細胞分為1)對照組，2)BMSCs+Dex組3)BMSCs+GDF-5組4)BMSCs+Dex+GDF-5組(聯合誘導組)5)NPCs組。誘導培養21 d，鏡下觀察細胞形態及密度變化，阿辛藍染色檢測蛋白多糖，RT-PCR檢測COL1、ACAN、SOX9及COL2和髓核細胞陽性基因KRT19、PAX1和FOXF1的表達。Western blot檢測COL2及COL1蛋白表達。結果BMSCs形態呈長梭型、漩渦樣生長；NPCs呈球形、島狀生長的特點；誘導后BMSCs向類圓形、三角形轉變，細胞體積縮小，胞質顏色與對照組相比逐漸加深；蛋白多糖分泌增加，以聯合誘導效果最佳。ACAN、SOX9、COL2基因的相對表達量逐漸增高，ACAN/COL2的比例呈遞增趨勢，COL1的表達呈遞減趨勢。NPCs陽性基因KRT19、PAX1、FOXF1與對照組相比(P<0.05)。含GDF-5的誘導組COL2蛋白表達高于對照組(P<0.05)，而聯合誘導組COL1蛋白的表達最少。結論GDF-5可以誘導大鼠BMSCs向類髓核樣細胞分化，且地塞米松能起到顯著促進作用，為BMSCs移植治療椎間盤退變提供了理論依據。

GDF-5；地塞米松；BMSCs；分化；類髓核樣細胞

下腰痛是當今困擾人們正常生活最普遍的疾病之一，椎間盤退變是引起下腰部疼痛的最主要因素，其中髓核組織在遭受形態學及細胞變性后而導致其自身硬化以及椎間盤高度和靈活度的下降是椎間盤退變的主要原因[1]。目前在治療上只能通過椎間盤切除的方式給患者帶來顯著的前期效果，但最終未能解決椎間盤退變的根本問題。

隨著生物醫學快速發展，利用干細胞分化技術和生長因子治療椎間盤退變已成為全球關注的重點。大量研究表明骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)具有強大的多分化潛能，并且在體外特殊條件下具有向髓核細胞表型分化的可能[2]。而地塞米松(dexamethasone，Dex)在促進軟骨細胞增殖方面也有大量報道，本實驗擬通過地塞米松聯合生長分化因子5 (growth and differentiation factor-5，GDF-5)體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞向類髓核樣細胞分化，探討其向類髓核樣細胞分化的潛能以及聯合誘導的優勢，為BMSCs治療椎間盤退變提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:3周齡清潔級SD大鼠雌雄不限，(武漢大學動物實驗中心，合格證號：HNASLKJ20122049)。

1.1.2 主要試劑:DMEM/F12培養基(Hyclone公司)；DMEM高糖培養基、胎牛血清(Gibco公司)；Recombinant murine GDF-5 (PeproTech公司)；地塞米松(Sigma公司)；0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、Ⅱ型膠原蛋白酶、Alcian Blue 8GX(Solarbio公司)；GREENspin細胞RNA快速提取試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)；HiFi-MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒、Goat Anti-Rabbit IgG, HRP(北京康為世紀生物科技有限公司)； 2×Taq Master Mix(欣百諾生物有限公司)，引物合成(南京金斯瑞生物科技公司)、GAPDH多克隆抗體、COL1A2多克隆抗體(Proteintech公司)，Rabbit Anti-Collagen Ⅱ(PL Laboratories公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs及NPCs分離培養：用全骨髓貼壁法及序貫酶消化法分別培養大鼠BMSCs和NPCs(髓核細胞)，消毒處理大鼠后，分別提取大鼠長骨骨干髓腔中的骨髓液及椎間盤髓核組織，經不同方法處理后[3- 4]，骨髓懸液采用10%胎牛血清的DMEM/F12培養，待細胞長至90%匯合按1∶3傳代。髓核細胞懸液采用10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養，待細胞匯合90%以上按1∶2傳代，期間鏡下觀察細胞生長情況。均取第3代細胞用于實驗。

1.2.2 BMSCs向類髓核樣細胞分化：取第3代BMSCs，常規消化后，調整細胞濃度為1×105個/mL，接種于24孔板中，并按以下分組更換誘導液：1)對照組(只含BMSCs)；2)BMSCs+地塞米松組；3)BMSCs+GDF-5組；4)BMSCs+Dex+GDF-5(聯合誘導)組。5)NPCs組，同時將BMSCs調整濃度為1×106/mL接種于6孔板中，每孔依次按上述方法分為4組，另取第3代NPCs，常規消化后調整細胞濃度為1×106個/mL接種于同一塊6孔板中，上述5組細胞均采用5% FBS+DMEM高糖培養基，其中地塞米松的終濃度為100 nmol/L，GDF-5的終濃度為100 ng/mL，每2天1次換液，誘導培養21 d。

1.2.3 聚集蛋白聚糖的阿辛藍染色:4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS漂洗1次，0.1 mol/L 鹽酸溶液漂洗5 min，pH降至1.0，1%阿辛藍染色過夜，0.1 mol/L鹽酸溶液洗脫非特異性染色。

1.2.4 RT-PCR檢測相關基因的mRNA：誘導培養21 d后，將5組細胞按RNA快速提取試劑盒說明書提取總RNA，并按試劑盒說明書要求進行反轉錄及擴增后電泳，凝膠成像系統軟件分析。此次實驗目的基因如下表，其中以GAPDH作為內參(表1)。

表1 RT-PCR引物序列及產物大小

F.forward;R.reverse.

1.2.5 Western blot檢測COL2、COL1蛋白:誘導培養21 d后，取1～4組按總蛋白提取試劑盒要求提取蛋白，并用2%十二烷基磺酸鈉溶液溶解蛋白樣品。每組蛋白上樣量為50 μg(10～15 μL)，SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜、TBST室溫封閉2 h。4 ℃孵育過夜一抗COL2多克隆抗體(稀釋比例1∶100)、COL1多克隆抗體(稀釋比例1∶800)，采用GAPDH做為內參(稀釋比例1∶2 000)，洗膜后采用二抗(稀釋比例1∶4 000)室溫孵育2 h，曝光、定影后晾干拍照，Image J軟件分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行試驗數據分析，數據以(均值±標準差)表示，組間比較采用單因素方差分析，Scheffe檢驗法進行兩兩比較。

2 結果

2.1 BMSCs和NPCs體外分離培養

原代培養第3天，鏡下可見BMSCs部分細胞呈貼壁狀態，細胞形態呈短梭形、紡錘形、多角形，細胞生長至第10天時90%匯合，細胞連接緊密，形態呈長梭形、多角形，細胞呈漩渦樣生長，排列近似魚群樣。經傳代純化后，第3代細胞形態大致呈單一的長梭形，分布均勻，呈典型的魚群樣生長(圖1A,B,C)。

原代培養第3天，鏡下可見NPCs貼壁細胞，且呈島狀分布，形態呈多角形、三角形、類圓形及不規則等。待細胞生長至20 d時85%匯合，細胞形態呈橢圓形、球形及三角形，經幾次傳代后，第3代髓核細胞主要呈三角形及類圓形生長(圖1D,E,F)。

2.2 BMSCs向類髓核樣細胞分化的結果

含GDF-5及Dex組誘導培養21 d后細胞密度逐漸增加且細胞形態由長梭形逐漸向類圓形、三角形及不規則形態轉變，細胞體積縮小，胞質顏色逐漸加深，胞核位于細胞中央清晰可見(圖2B,C,D)，上述現象以(3)、(4)組更為典型(圖2E,F)，而對照組類似細胞罕見(圖2A)。

2.3 Alcian Blue染色的結果

誘導21 d后，含GDF-5及地塞米松誘導組通過阿辛藍染色后可見陽性染色物質，而對照組未見明顯特異性染色顆粒(圖3)。

2.4 RT-PCR檢測結果

ACAN、SOX9和COL2 mRNA的相對表達量均呈遞增的趨勢，高于對照組(P<0.05)，且聯合誘導組上述3組基因的相對表達量接近NPCs的表達，同樣ACAN/COL2的比值也趨近于NPCs。COL1以NPCs表達量最低，且聯合誘導組的相對表達量近似于NPCs。KRT19、PAX1和FOXF1的mRNA的相對表達量遠高于對照組(P<0.01)(圖4)。

A.Primary BMSCs cultured for 3 days; B.Primary BMSCs cultured for 10 days; C.BMSCs at passage 3 cultured for 3 days; D.Primary NPCs cultured for 3 days; E.Primary NPCs cultured for 20 days;F.NPCs at passage 3 cultured for 3 days

圖1細胞形態學的觀察
Fig1Cellularmorphologyobservation(×100)

A.group control cultured for 21 days(×100);B.group BMSCs+Dex induced for 21 days(×100);C.group BMSCs+GDF-5 induced for 21 days(×100);D.group BMSCs+Dex+GDF-5 induced for 21 days(×100);E.group BMSCs+GDF-5 induced for 21 days(×200);F.group BMSCs+Dex+GDF-5 induced for 21 days(×200)

圖2Dex和GDF-5誘導21d后BMSCs的形態改變
Fig2BMSCsmorphologicalchangesinducedbyDexandGDF-5for21days

2.5 Western blot檢測結果

(3)和(4)組COL2含量較(1)和(2)明顯增加(P<0.001)，且以聯合誘導組COL2含量最高。經聯合誘導后的骨髓間充質干細胞COL1表達量比單純加入Dex和GDF-5組顯著降低(圖5，表2)。

A.group control cultured for 21 days; B.group BMSCs+Dex induced for 21 days; C.group BMSCs+GDF-5 induced for 21 days; D.group BMSCs+Dex+GDF-5 induced for 21 days

圖3Dex和GDF-5誘導21d后細胞分泌蛋白多糖量的變化
Fig3ThecontentofcellssecretoryproteoglycanchangesinducedbyDexandGDF-5for21days(×100)

A.electrophoresis;B.relative mRNA expression ofACAN,COL2,SOX9andCOL1;C.relative mRNA expression ofKRT19,PAX1andFOXF1;D.ratioACAN/COL2;*P<0.01 compared with control;#P<0.05 compared with BMSCs+GDF-5;*#P<0.01 compared with control;ΔP<0.001 compared with control

圖4誘導21d后BMSCs相關基因的表達水平
Fig4GeneexpressionofBMSCsinducedfor21days

圖5 GDF-5和Dex對骨髓間充質干細胞COL2和COL1蛋白表達的影響Fig 5 Electrophoresis of COL2 and COL1 proteins expression in bone marrow mesenchymal stem cells induced by GDF-5 and Dexamethasone

groupsCOL2COL1BMSCs(control)18469±0061318579±01069BMSCs+Dex26098±0155121269±00144BMSCs+GDF?535533±01263?11893±00090?BMSCs+Dex+GDF?538440±00749?#07501±01151?#

*P<0.001 compared with control,#P<0.05 compared with BMSCs+GDF-5.

3 討論

目前，已證實有兩種再生法能成功治療早期腰椎間盤退變，一種為注射生長因子[5]，其次是自體造血干細胞的應用[6]。研究發現轉化生長因子家族中生長和分化因子5(GDF-5)能促進軟骨細胞和退變椎間盤細胞的增殖及細胞外基質的合成[7]；自體BMSCs具有強大的多向分化潛能，能向骨、軟骨、肌肉、 肌腱和神經組織分化[8]， 也具備向椎間盤組織分化的潛能[2]。研究發現地塞米松在軟骨細胞的增殖方面起顯著作用。如地塞米松對水凝膠培養的兔軟骨細胞中發現其能促進軟骨細胞的增殖，并能增加軟骨相關蛋白的表達量(如Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖等)[9]。一定劑量的地塞米松連續作用BMSCs 21 d后，能誘導干細胞向軟骨細胞分化，并能促進軟骨細胞的轉錄基因SOX9表達量增高[10]。

研究表明，關節軟骨細胞形態常呈圓形或橢圓形，髓核細胞通常被稱為“類軟骨細胞”，呈球形并主要表達聚集蛋白聚糖(ACAN)、COL2和SOX9基因[11]，與軟骨細胞的標記基因相同[12]，且兩者均富含蛋白多糖成分。本實驗結果證實，誘導后的BMSCs形態上能向圓形及球形細胞變化，并且上述3種基因的相對表達量明顯高于BMSCs對照組，蛋白多糖及COL2蛋白的表達量呈遞增趨勢。由此說明經GDF-5誘導后的BMSCs有向類髓核樣細胞分化的潛能，且地塞米松起到顯著促進作用。

細胞角蛋白-19(Cytokeratin-19，KRT-19)是大鼠髓核細胞的表面標志物，在人類的髓核細胞中也同樣表達[13]。同時，聚集蛋白聚糖(ACAN)與COL2之間的基因表達比例可作為評估類椎間盤分化軟骨細胞的指標[14]。且研究發現髓核細胞的陽性基因即表面標志物還包括PAX1以及FOXF1，它們是區分髓核細胞及軟骨細胞關鍵因素[15]。本研究結果顯示，KRT19、PAX1和FOXF1的mRNA表達量呈遞增趨勢，并接近NPCs表達量，進一步證實聯合誘導后的BMSCs能向類髓核細胞分化。實驗中COL1作為誘導軟骨的對照基因，結果顯示聯合誘導組COL1基因表達量最低，說明誘導后的細胞能穩定表達軟骨細胞的表型。

綜上所述，GDF-5及地塞米松聯合誘導后的BMSCs能向類髓核樣細胞表型分化并具有一定分泌細胞外基質的功能，為今后BMSCs治療椎間盤退變提供了更好的理論依據。

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Differentiation of rat BMSCs into nucleuspulposus-like cells induced by GDF-5 and dexamethasone

WEI Qiang-qiang1,2,3, YIN Chang-chang1*, YIN Ming2, HE Ding-wen2,ZHOU Rong-ping2, LIANG Guang-sheng2,3

(1.Translational Medicine Laboratory of Jiujiang University, Jiujiang 332000；2.First Dept. of Orthopedics，the Second AffiliatedHospital of Nanchang University; 3.Dept. of Medicine Graduate School of Nanchang University,Nanchang 330006, China)

ObjectiveTo investigate the NP-like cell differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells induced by GDF-5 and Dexamethasone.MethodsBMSCs were collected from Sprague Dawley rats and the feasibility of isolating and culturing rats nucleus pulposus cells (NPCs)by the sequential enzyme method.Cells at passage 3 were used and divided into control group,group of BMSCs+Dex,group of BMSCs+GDF-5,group of BMSCs+Dex+GDF-5,group of NPCs,then the cellular morphology was observed under microscope and induced for 21 days.Alcian Blue stain showed the changes of proteoglycan,RT-PCR detected expressionCOL1，ACAN,SOX9,COL2 and positive genes of nucleus pulposus cells forKRT19,PAX1,FOXF1. Western blot was used to detect COL2 and COL1.ResultsBMSCs presented a single long spindle with whirlpool-like morphology; NPCs presented spherical characteristics and island growth. BMSCs became circles, triangles, then shrinkaged and the cytoplasmic color of cells gradually deepened as compared with the control group.The content of proteoglycan was increased obviously by Co-induction.The relative expression levels of genes ofACAN,SOX9,COL2 were gradually increased,and the proportion of whichACAN/COL2 showed an increasing trend. The mRNA expression ofCOL1 showed a decreasing trend. The positive genes of NPCs forKRT19,PAX1,FOXF1 were significant different as compared with control group(P<0.05).The expression of COL2 protein in GDF-5 group was significantly increased as compared with control group (P<0.05),then the expression of COL1 protein was minimum by Co-induction.ConclusionsGDF-5 may induce rat BMSCs to differentiate into NP-like cells and dexamethasone plays a promotion effect in the differentiation of induction, and provides a theoretical basis for BMSCs transplantation in the treatment of intervertebral disc degeneration.

GDF-5；dexamethasone；BMSCs；differentiation；NP-like cells

2013- 09- 26

2013- 11- 21

國家自然科學基金(81160226)

*通信作者(correspondingauthor)： yinchangchang112@163.com

1001-6325(2014)08-1037-07

R 318.08

A

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早吃午餐較不易發胖

據英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年1月30日報道，西班牙的研究發現，早吃午餐的人，會比晚吃午餐的人減輕更多體質量。

這項研究無法證明，提早午餐時間有助減掉多余脂肪，但研究人員認為，可能原因是用餐時間在身體管理體質量上起到重要作用。

研究共同作者、來自哈佛醫學院與布里翰婦女醫院(Brigham and Women’s Hospital)的謝爾(Frank Scheer)說：現在應該開始認真考慮進食的時間，不僅僅是吃了什么，還要注意吃飯的時間。

謝爾的研究團隊以西班牙東南部營養門診的420名患者為研究對象。這些試驗者采取地中海式飲食，1 d在午餐時攝取當天熱量的40%，約50%研究對象在下午3∶00之前吃午餐，另50%則在下午3∶00之后。

持續20周， 提早吃午餐的人體質量平均減22磅(約10 kg)，約占體質量的11%，較晚吃午餐的人體質量則減輕17磅(約7.7 kg)，比原體質量減少了9%。至于早餐或晚餐進食時間，與最后減去多少體質量沒有關系。

研究發表在《國際肥胖期刊》(International Journal of Obesity)。