RGD和細胞穿膜肽共修飾脂質體的構建及其體外功能評價

趙炳芬

(勝利油田 中心醫院 腫瘤科， 山東 東營 257034)

研究論文

RGD和細胞穿膜肽共修飾脂質體的構建及其體外功能評價

趙炳芬*

(勝利油田 中心醫院 腫瘤科， 山東 東營 257034)

目的制備RGD和TAT共修飾載紫杉醇(PTX)脂質體(RGD/TAT-LP-PTX)，研究其理化性質和體外抗腫瘤作用。方法薄膜分散法制備RGD/TAT-LP-PTX，研究其理化性質；檢測肝癌HepG2細胞對RGD/TAT-LP的攝取效率以及脂質體的攝取機制。共聚焦實驗研究腫瘤細胞對脂質體的攝取。MTT檢測RGD/TAT-LP-PTX對HepG2細胞的增殖抑制作用。結果RGD/TAT-LP-PTX的粒徑134.5±8.4 nm，電位為22.35±2.55 mV，紫杉醇的包封率84.6%。RGD/TAT-LP在4 h攝取效率是2 h的1.65倍(P< 0.05)；HepG2細胞在4 h對RGD/TAT-LP的攝取效率分別是TAT-LP、RGD-LP和LP的2.2倍、2.7倍和3.9倍(P< 0.01)；RGD/TAT-LP-PTX在24 h HepG2細胞的存活率是48 h的1.75倍(P< 0.05)；給藥48 h后，TAT-LP-PTX、RGD -LP-PTX和LP-PTX的細胞存活率分別是RGD/TAT-LP-PTX組的1.65倍、1.74倍和2.1倍(P< 0.01)。結論RGD和TAT共修飾紫杉醇脂質體是一種潛在高效的腫瘤靶向給藥系統。

整合素受體；細胞穿膜肽；脂質體；腫瘤靶向

在過去幾十年，隨著現代生物研究的進展，對腫瘤疾病的治療手段日益豐富。其中腫瘤的靶向治療成為了腫瘤治療研究的熱點[1]。脂質體是最常用的一種靶向給藥載體，具有良好的生物相容性，可表面修飾實現主動靶向[2]。TAT作為一種強效的細胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPP)被廣泛應用于納米載體的研發中，以提高納米載體的入胞能力[3]。有研究表明，腫瘤細胞表面有整合素受體高度表達[4]。本研究以脂質體為載體，制備了RGD和細胞穿膜肽共修飾紫杉醇脂質體，并對其理化性質和體外活性進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆磷脂(SPC，上海太偉藥業有限公司)；膽固醇(Chol，Sigma公司)；DSPE-PEG2000和FITC標記的磷脂(Avanti polar lipids公司)；DMEM高糖培養基和胎牛血清(Gibco公司)；其余試劑為分析純。人源肝癌細胞(HepG2，ATCC)。

1.2 方法

1.2.1 肝癌HepG2細胞的培養：將HepG2細胞置于含有100 mg/L胎牛血清的DMEM培養基中培養，培養條件為5% CO2，飽和濕度，溫度為37 ℃。待細胞匯合度為0.8～0.9時，用2.5 mg/L胰蛋白酶消化傳代，取增殖期細胞進行實驗。

1.2.2 RGD/TAT-LP-PTX的制備及其表征:參照文獻[5- 6]方法合成DSPE-PEG2000-RGD和DSPE-PEG2000-TAT。將處方量的紫杉醇，SPC，Cho，DSPE-PEG3500-RGD，DSPE-PEG2000-TAT，DSPE-PEG-OMe(保證總磷脂∶膽固醇=75∶25(摩爾比)，分別溶于三氯甲烷，置50 mL茄形瓶中旋轉蒸發成膜后，真空干燥器中過夜。加入2.5 mL PBS緩沖液(pH 7.4)，置空氣浴搖床中，37 ℃，180 r/min，20 min水化，水浴超聲5 min脫膜，探頭超聲制備得到RGD與TAT共修飾的紫杉醇脂質體或者FITC標記脂質體。

采用葡萄糖凝膠柱色譜法分離脂質體與未包載的紫杉醇，將過柱后的脂質體采用triton-100破乳，用HPLC法在227 nm檢測紫杉醇含量。按照EE%=W包/W投×100%計算包封率。W包：脂質體中包載的藥物量。W投：制備脂質體的投藥量。

1.2.3 RGD/TAT-LP-PTX的血清穩定性:取脂質體樣品500 μL，每個樣品3份。分別與等體積的磷酸鹽緩沖液、含有50%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液混合，于37 ℃下孵育1、4、8、12和24 h，分別測定其在750 nm的透光率。以樣品在磷酸鹽緩沖液中的透光率值為空白，以樣品在含有50%FBS的磷酸鹽緩沖液中的透光率與其在磷酸鹽緩沖液中透光率的比值來評價納米粒在血清中的穩定性。

1.2.4 HepG2細胞對FITC標記脂質體的攝取及攝取機制：將對數生長期的細胞以5×105個/孔接種于6孔板中，37 ℃培養24 h后，每孔加入適量FITC標記的LP、TAT-LP、RGD-LP和RGD/TAT-LP，使孔中脂質體為0.20 μg/mL，37 ℃分別孵育2和4 h后除去含脂質體培養基，冷PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶消化后離心，PBS清洗3次，流式細胞儀測定細胞熒光值。

為了定性觀察細胞對脂質體的攝取，將脂質體與細胞共同孵育4 h后，將細胞用PBS漂洗3次，加入2 μg/mL 4′,6-聯脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽溶液，室溫孵育20 min，加冰PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛，置激光共聚焦顯微鏡觀察細胞攝取。

為了檢測脂質體的攝取機制，將對數生長期的細胞以5×105個/孔接種于6孔板中，37 ℃培養24 h后，每孔加入適量FITC標記的LP、TAT-LP、RGD-LP和RGD/TAT-LP，使孔中脂質體為0.20 μg/mL，分別控制溫度、多聚賴氨酸以及不同胞吞抑制劑孵育4 h后，流式細胞儀測定熒光值。

1.2.5 MTT檢測不同脂質體對腫瘤細胞的增殖抑制作用：培養HepG2細胞接種于96孔板中，當孔板中細胞完全貼壁且處于對數生長期時加入無菌過濾后的脂質體，使每孔為6.5 μmol/mL。將孔板移入37 ℃ CO2孵箱中培養24和48 h后取出，每孔加入20 μL 5 g/L MTT溶液，再放回孵箱中繼續孵育4 h，將孔板中液體倒出，每孔加入200 μL DMSO，37 ℃避光振搖15 min，用酶標儀在490 nm處測定各孔的吸光度(A)值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 脂質體的表征

取適量脂質體用磷鎢酸染色，采用透射電鏡(TEM)觀察形態(圖1)，制備的脂質體成球狀，形態均一。紫杉醇的包封率為84.6%，粒徑和電位(表1)。

圖1 RGD/TAT-LP-PTX的透射電鏡照片Fig 1 Transmission electron microscopy image of the RGD/TAT-LP-PTX(×10 000)

formulationsize/nmPDIzeta?potential/mVLP988±540130±0050-252±356RGD?LP1119±1040120±0030 282±216TAT?LP1155±980110±00602182±313RGD/TAT?LP1345±840140±00502235±255

2.2 脂質體的血清穩定性

各組脂質體在50%的血清中的透光率與其在PBS中的透光率的比值均大于90%，表明4種脂質體24 h在血清中均具有較好的穩定性(表2)。

2.3 HepG2細胞對脂質體的攝取和攝取機制

RGD/TAT-LP在4 h攝取效率是2 h的1.65倍(P< 0.05)(圖2)。肝癌HepG2細胞在與脂質體共同孵育4 h后對RGD/TAT-LP的攝取效率分別是TAT-LP、RGD-LP和LP的2.2倍、2.7倍和3.9倍(P< 0.01)；RGD/TAT-LP組熒光強度顯著強于其他組(圖3)。4 ℃條件下，RGD/TAT-LP的攝取下降88%，NaN3使脂質體的攝取下降19%。多聚賴氨酸使脂質體的攝取下降55%。秋水仙素和氯丙嗪分別使脂質體的攝取下降15%和45% (圖4)。

*P< 0.01 compared with RGD/TAT-LP at 2 hours;#P< 0.01 compared with RGD-LP,TAT-LP and LP圖2 HepG2細胞不同時間對不同脂質體的攝取效率Fig 2 Uptake of different liposomes by HepG2 cells

2.4 不同脂質體抑制HepG2細胞的增殖

RGD/TAT-LP-PTX對肝癌HEPG2細胞的增殖抑制率隨著時間的延長而增長，RGD/TAT-LP-PTX在24 h肝癌HepG2細胞的存活率是48 h的1.75倍(P< 0.01)；在給藥48 h后，TAT-LP-PTX、RGD-LP-PTX和LP-PTX的細胞存活率分別是RGD/TAT-LP-PTX組的1.65倍、1.74倍和2.1倍(P< 0.01)(圖5)。

表2 不同脂質體在50% FBS中的透光率變化Table 2 The transmittancy variation of liposomes in 50% FBS

圖3 激光共聚焦觀察HepG2細胞對FITC標記脂質體的攝取Fig 3 Uptake of FITC labelled liposomes by HepG2 cells based on confocal laser scanning microscopy(×2 000)

*P< 0.05 compared with PBS group圖4 各種抑制劑對HepG2細胞攝取的影響Fig 4 Effect of endoeytosis inhibitors on the celluar uptake of liposomes in HepG2 cells

*P< 0.01 compared with saline group； #P< 0.01compared with RGD-LP-PTX and TAT-LP-PTX圖5 HepG2細胞在不同脂質體MTT實驗中的存活率Fig 5 HepG2cell viability at various drugs at 24 and 48 hours after the treatment

3 討論

細胞穿膜肽TAT能夠穿過與之相接觸的任何細胞的細胞膜，而對細胞膜沒有損傷[7]。TAT修飾的脂質體用于腫瘤靶向給藥已經被廣泛研究，然而其缺乏選擇性也限制了TAT在全身系統給藥中的應用[3]。整合素αvβ3在神經膠質瘤、黑色素瘤和肝癌等多種腫瘤細胞及腫瘤相關的內皮細胞表面高度表達，因此整合素αvβ3常被用作腫瘤靶向的特異性靶點[8]。有研究表明，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)的三肽序列能夠特異性地識別含αv亞基的整合素家族，具有高度親和力。本研究制備的脂質體通過EPR效應到達腫瘤部位，再通過RGD識別高度表達整合素受體的腫瘤細胞，與細胞結合，通過穿膜肽TAT的高效穿膜作用，進入腫瘤細胞。

本研究制備得到的共修飾脂質體的粒徑為130 nm左右，有研究顯示，納米載體的粒徑范圍在10～150 nm能夠有效避開網狀內皮系統的吞噬，通過實體瘤的高通透性和滯留效應(enhanced permeability and retention effect，EPR)到達腫瘤組織[2]。在細胞攝取實驗中，與普通脂質體相比，經過RGD或者TAT修飾都能夠顯著增強腫瘤細胞對脂質體的攝取，其中對共修飾脂質體的攝取效率顯著高于RGD或者TAT單獨修飾的脂質體，這說明二者發揮了協同作用，共同促進入胞。載藥系統的細胞毒性以及釋藥能力等與其細胞攝取途徑密不可分，不同配體修飾載體產生的攝取機制不同，因此本研究考察了溫度、能力抑制劑NaN3、多聚賴氨酸以及各種胞吞抑制劑對RGD/TAT-LP在HepG2細胞中攝取的影響，從而研究修飾脂質體的細胞攝取機制。結果顯示，RGD/TAT-LP的入胞依賴巨胞飲和網格蛋白介導的溫度、電荷以及能量依賴的過程。通過腫瘤細胞增殖抑制實驗證實經過雙配體修飾后脂質體能夠增強對腫瘤細胞的增殖抑制能力，這與細胞攝取的實驗結果相一致，這說明脂質體的細胞毒性依賴于腫瘤細胞對脂質體的攝取效率。綜上所述，RGD/TAT-LP是一種潛在高效的腫瘤靶向給藥系統。

[1] Qin Y,Chen H, Zhang Q,etal. Liposome formulated with TAT-modified cholesterol for improving brain delivery and therapeutic efficacy on brain glioma in animals[J]. Int J Pharm, 2011, 420:304- 312.

[2] Zhang L, Zhang LF. Lipid-polymer hybrid nanoparticles: synthesis, characterization and applications[J]. Nano LIFE, 2010, 1: 163- 173.

[3] Khalil IA, Kogure K, Futaki S,etal. Octaarginine-modified liposomes: Enhanced cellular uptake and controlled intracellular trafficking[J].Int J Pharm,2008,354:39- 48.

[4] Oba M, Fukushima S, Kanayama N,etal. Cyclic RGD peptide-conjugated polyplex micelles as atargetable gene delivery system directed to cells possessing αvβ3 and αvβ5 integrins[J]. BioconjugChem, 2007, 18:1415- 1423.

[5] Kuai R, Yuan W, Qin Y,etal. Efficient Delivery of Payload into Tumor Cells in a Controlled Manner by TAT and Thiolytic Cleavable PEG Co-Modified Liposomes[J]. Mol. Pharmaceutics, 2010,7:1816- 1826.

[6] Zhang Q, Tang J, Fu L,etal. A pH-responsive a-helical cell penetrating peptide-mediated liposomal delivery system[J].Biomaterials,2013,34:7980- 7993.

[7] Qin Y, Chen H, Yuan W,etal.Liposome formulated with TAT-modified cholesterol for enhancing the brain delivery[J].Int J Pharm,2011,419:85- 95.

[8] Ying X, Wen H, Lu WL,etal. Dual-targeting daunorubicin liposomes improve the therapeutic efficacy of brain glioma in animals[J].J Controlled Release,2010,141:183- 192.

The preparation and characterization of RGD and the function ofcell penetrating peptides co-modified paclitaxel loaded liposomeinvitro

ZHAO Bing-fen*

(Dept. of Oncology，Shengli Oilfield Central Hospital，Dongying 257034, China)

ObjectiveTo prepare RGD and TAT co-modified paclitaxel loaded liposome(RGD/TAT-LP-PTX)for HepG2cells targeting.MethodsThe co-modified liposome was prepared by film-ultrasonic method. The appearance，particle size，Zeta potential were evaluated. The cellular uptake by HepG2cellsinvitrowas used to evaluate the targeting efficiency. The anti-proliferation efficiency of RGD/TAT-LP-PTX was evaluated by MTT assay.ResultsThe particle diameter of the co-modified liposome was 134.5±8.4 nm with the Zeta potential of 22.35±2.55mV. The entrapment efficiency of PTX was 84.6%. The result demonstrated that the co-modified liposome uptakes by HepG2 were 2.2, 2.7 times higher than that of TAT-LP and RGD-LP, respectively.The MTT assay demonstrated that the cell viability of TAT-LP-PTX，RGD-LP-PTX and LP-PTX were 1.65, 1.74 and 2.1 times higher than that of RGD/TAT-LP-PTX respectively.ConclusionsThe co-modified liposome may function as a promising tumor delivery system of antitumor drugs.

integrin receptor；cell penetrating peptides；liposomes；tumor targeting

2013- 12- 24

2014- 03- 24

*通信作者(correspondingauthor)：527236911@qq.com

1001-6325(2014)08-1083-05

R 735.7

A